基质金属蛋白酶酶谱分析法

基质金属蛋白酶酶谱分析法刘　煜　张嘉宁　朱正美

基质金属蛋白酶(m atrix m etallop ro teinases, MM P s)是一组重要的蛋白水解酶,可以水解细胞外基质中胶原、纤维连接蛋白等多种成分[1],参与了人体内许多生理和病理过程,如骨的重建[2]、肿瘤转移[3]等都与MM P s密切相关。近年来研究发现MM P s与生殖过程关系密切[4,5],如在月经的发生,着床与分娩过程都有一定的MM P s的变化,因而对MM P s的活性及种类的分析有着很重要的意义。目前分析MM P s活性及酶量的方法有多种,其中酶谱法是将非还原性SD S2 PA GE电泳分析酶种类与检测酶活性有效结合的一种酶学方法。尤其是具有在电泳中可将组织内与MM P s 紧密结合的组织抑制剂(T I M P s)分离,进而表现出酶的活性,从而达到在分离不同MM P s的同时又可直接显示其活性条带一举两得的特点。鉴于MM P s酶谱分析法具有方法灵敏,结果直观,能同时观察酶与酶原种类和活性等优点,且其方法较简便,适于在不同实验室应用。本研究用早孕子宫内膜样品经组织培养后,将其所分泌的MM P s运用酶谱分析法进行鉴别种类和活性分析,对方法的实验原理及条件进行了介绍,并就其优缺点进行讨论。

一、材料与方法

11材料:丙烯酰胺(A cry),十二烷基磺酸钠(SD S),T riton2X100,Pep statine A,苯甲基磺酰氟(P M SF),N,N2亚甲基丙烯酰胺(B is),1,10菲洛林(1,10phenan th ro line),ED TA,明胶蛋白,DM E M F12无血清培养基,考马斯亮蓝G250,以上均为Sig2 m a公司产品;冰醋酸,甲醇(国产分析纯);72、92×103明胶酶标准品(美国N I H,D r.Stetler2Steven son W G 惠赠)。

21子宫内膜组织块培养:子宫内膜用灭菌冷生理盐水冲洗血迹后,剪成2mm2大小,在24孔培养板中加重量约50m g 孔组织块及1m l培养基后,于5% CO2、37℃条件下,培养5小时,收集上清,-20℃冰箱冻存用于酶谱分析[6]。

31酶谱法:实验原理:MM P s与SD S结合使MM P s结构发生改变,后经SD S2PA GE电泳,将分子量不同的MM P s以及与MM P s结合的组织抑制剂同时分离,再用T rti on2X100除去SD S,在这一过程中引发了MM P s酶原蛋白体外活化机制,酶原在凝胶内除掉一个约10×103的小肽,转变为有活性的酶。MM P s 在体内常以酶原形式分泌并可被纤溶酶等物质激活[7],活化后的MM P s,在除掉SD S后也可以恢复酶活性,在酶谱上称之为活性型MM P s,从而与酶原相区别,由于它在体内已具有水解胶原等基质的作用,因而在功能上的意义要大于相应的酶原。经过酶的复性及酶原的活化后,凝胶内已经具有活性的MM P s则可在适宜的条件下将其所在位置的底物明胶蛋白或其它底物蛋白(制凝胶时已均匀掺入其中)水解,然后用考马斯亮蓝G250染色,再用脱色液脱色,结果见凝胶普遍蓝染,而底物被水解处即可见到清晰的透明条带,根据其透明的程度及面积的大小判断其酶活性的高底,该方法还可以通过变换底物,从而用来研究不同种类的MM P s。如用酪蛋白做底物研究基质溶解素等。

取上述收集的培养上清50Λl加入10Λl样品缓冲液(含1714%SD S,7%蔗糖)混匀后即可进行上样,然后将含有1m g m l明胶蛋白的10%的丙烯酰胺凝胶加入V216垂直电泳槽中,按照L aem n li[8]方法进行电泳,结束后将凝胶置于培养皿中,加入215%T riton2 X100100m l,振荡,重复洗6次,每次5分钟,再用T ris HC l缓冲液(50mmo l L T ris,pH714)冲洗3次,每次5分钟,之后将凝胶放入反应液中(50mmo l L T ris,pH714,200mmo l L N aC l,10mmo l L CaC l2), 37℃培养18小时(该步骤可根据实验要求分别加入1, 10phenan th ro line1mmo l L,ED TA20mmo l L,Pep2 statine A1mmo l L,P M SF20mmo l L等不同的蛋白酶抑制剂,用以鉴定MM P s存在),然后将凝胶置于011%考马斯亮蓝G2250染色液中染色1小时,最后放入脱色液(5%甲醇,715%冰醋酸)中进行脱色[9]。

二、结果

11早孕子宫内膜的MM P s酶谱:应用酶谱法从早 作者单位:116027　大连医科大学生化教研室

孕内膜培养液中可以明确分离得到5种MM P s ,其中

92×103的酶(MM P 29酶原)和72×103的酶(MM P 22

酶原)活性较高,占MM P s 酶总活性的大部分。66×103的酶(MM P 22活性型)活性较低,其余两种酶种类不明

(图1)。

21不同的蛋白酶抑制剂对早孕内膜分泌的酶的活性抑制:酶与底物(明胶)作用过程中,加入不同的蛋白酶抑制剂,可见:1,10phenan th ro line

1mmo l L (MM P s 特异性抑制剂)可以完全抑制酶对底物明胶的

水解活性,ED TA 20mmo l L 可以抑制酶的大部分活性,Pep statine A 1mmo l L P M SF 20mmo l L 等其他蛋白酶抑制剂不能抑制酶的活性,上述结果可以提示酶谱中的5种酶均为MM P s (图2)。

31不同培养时间的早孕内膜的MM P s 酶谱变化:早孕内膜经26小时培养(培养基为R 1640),每隔2小时取样进行酶谱分析。结果清晰显示:随培养时间的延长,MM P s 活性增加(72×103明胶酶A 除外)。提示酶谱的方法十分灵敏并可以反映出酶的量的变化(图3)

。

图1　早孕内膜分泌的MM P s 酶谱。1:72×103,92×103

明胶酶标准品,2～4分别为妊娠39、40、42天的早孕内膜分泌

的MM P s

图2　不同蛋白酶抑制剂对早孕内膜分泌的酶活性的抑

制。1:早孕内膜MM P s ,2:1,10phenanth ro line 抑制酶的活

性,3:ED TA 抑制酶的部分活性,4:Pep statine A 不能抑制

酶的活性,5:PM SF

不能抑制酶的活性

图3　经26小时培养早孕内膜的MM P s 酶谱

三、讨论

基质金属蛋白酶的种类较多且作用广泛,其底物

包括大部分的细胞外基质成分,其酶量及活性的分析方法较多,如EL ISA [10]、W estern 2b lo t [11]、荧光法、放射性同位素法[12]等。我们在应用过程中体会到酶谱法除前述优点外还具有无需特殊的试剂如MM P s 的抗体等,并且有酶的标准品则可对酶谱进行较为准确的酶量分析等优点。其不足之处,如不能反映组织抑制剂存在时的体内实际酶活性情况,酶活性准确定量比较困难等。此外,实验中MM P s 与SD S 的结合及MM P s 酶蛋白的复性阶段是实验过程成败的关键,所用SD S 的溶解度明显影响它从电泳凝胶中去除的难易度,充分

去除与酶蛋白结合的SD S 是酶谱法得到清晰结果的保证。此外聚丙烯酰胺凝胶的厚度也明显影响实验结果,凝胶薄,其中的SD S 较容易除掉,而且电泳时产热少,这样有利于酶的复性。