II型糖尿病模型的建立

II型糖尿病模型的建立
一、概述
糖尿病是一组由于遗传和环境因素相互作用，胰岛素相对或绝对缺乏以及靶组织对胰岛素敏感性降低（胰岛素抵抗）引起的碳水化合物、脂肪及蛋白质代谢紊乱的综合征，是一种持续高血糖为特征的、慢性、全身性代谢性疾病。

起病后若未得到有效治疗，随着病程的延长，可出现广泛的微血管及大血管病变，出现神经、泌尿、循环等多系统的病理改变。

目前糖尿病的分型采取的是1999年经世界卫生组织(WHO)咨询委员会认可的分型方法：（1）1型糖尿病：胰岛β细胞破坏，通常导致胰岛素绝对缺乏。

包括自身免疫性（急性型、迟发型）及特发性。

这类糖尿病患者必须用胰岛素治疗，过去又称胰岛素依赖型糖尿病。

（2）2型糖尿病：胰岛素抵抗为主伴胰岛素相对缺乏，或胰岛素分泌不足为主伴有胰岛素抵抗。

这类患者一般不需用胰岛素治疗，仅用饮食调节加用口服降糖药物即可控制血糖，过去又称为非胰岛素依赖型糖尿病。

（3）其他特殊类型：由胰腺内、外原因和其他疾病、药物引起的继发性糖尿病；（4）妊娠糖尿病。

我国糖尿病患者中1型糖尿病约占糖尿病的5.6%。

2型糖尿病约占糖尿病的93.7%。

其他类型糖尿病仅占0.7%[1]。

上世纪80年代以来，全球和我国的糖尿病患者人数显著增加，2003年全球糖尿病病人超过1.94亿。

有研究者预测到2010年全世界的糖尿病患者将达22亿1千万。

其潜在的最大增长人群在亚洲，约占总增长的65%以上[2]。

中国糖尿病患病率近年上升近3倍以上，20岁以上人群中糖尿病患者由1980年的1.0%上升到1996年的3.2%，患病人数占全球糖尿病病人的约1/5。

研制用于糖尿病防治的药物一直是新药开发中的热点和难点之一。

由于
糖尿病诊断分型的病理生理不同，在进行药效学研究时应根据适应症的不同选择不同的药效学试验方案。

二、相关药效学试验基本内容
1、动物选择：选用健康成年动物，常用小鼠或大鼠，也可选用兔、犬及猴等。

2、动物模型
（1）化学试剂诱发的高血糖动物模型：常用四氧嘧啶或链脲霉素（STZ），二者均可选择性的破坏胰岛β细胞，诱发动物高血糖，属于胰岛素低下型高血糖动物模型。

（2）正常动物：某些有刺激胰岛素分泌的降血糖药物，对正常动物可以表现出降血糖作用，但对于化学试剂诱发的高血糖动物模型无明显作用。

（3）自发性糖尿病动物：可分为二型：低血清胰岛素型，如BB大鼠，NOD小鼠及中国地鼠；高血清胰岛素型，如obese/SHR、SHR/N-cp大鼠，ob/ob、db/db、KK小鼠等。

（4）肾上腺素性高血糖模型：可根据情况选用。

3、观察指标
（1）血糖值测定：实验前动物禁食（自由饮水）3-8小时，然后给药，给药后1-3小时取血测定血清葡萄糖值。

给药一般可采用一次性或连续数日给药。

（2）糖耐量试验：试验时动物先禁食取血（为零时），然后给药，1小时后腹腔注射葡萄糖（2g/kg）或口服葡萄糖（2.5g/kg）。

淀粉（3-5g/kg）或蔗糖等双糖（2.5g/kg），测定给糖后0、0.5、1、2小时的血糖值或计算血糖曲线下面积。

（3）血清胰岛素测定：用放免法，具有刺激胰岛素分泌的药物，可选用正常动物或自发性糖尿病动物进行血清胰岛素水平的测定。

三、药效学试验注意点
1、关于模型制备
（1）四氧嘧啶诱导的高血糖动物模型
模型制备的成功与否受很多因素影响，如动物选择、给药剂量、途径等。

一般大鼠对四氧嘧啶较为敏感，犬则不敏感，豚鼠则抵抗。

造型剂量犬50-70mg/kg，静注；大鼠40mg/kg，静注，给药速度宜快。

相同剂量下，腹腔注射成功率较低，而皮下注射需要增加4-5倍量。

禁食是影响造型结果的另一因素，如大鼠禁食48小时，20mg/kg静注可使大多模型成功。

另外需注意的是，四氧嘧啶水溶液不稳定，pH3.0时室温稳定；pH7.0时要保存在4度以下。

大鼠、小鼠部分动物，大约30天可自发性缓解至正常；造型给药几小时内，有些动物，尤其家兔，有低血糖反应，甚至死亡，可静注葡萄糖急救。

造型时四氧嘧啶应新鲜配制，分组时各组动物的平均血糖值相差不宜大于20mg/dl，血糖值升高不符合要求的动物应剔除。

（2）链脲霉素（STZ）诱导的高血糖动物模型
STZ水溶液不稳定，对小鼠的生物半衰期仅有5min左右，需要快速静脉注射。

造型剂量犬50mg/kg，静注，可引起糖尿病，动物死亡率较高；如15mg/kg，连续3天也可。

大鼠60-80mg/kg，iv或ip，小鼠100-200mg/kg，iv或ip。

STZ诱导的高血糖动物模型一般不自发缓解。

需要注意的是，给药时常把STZ溶解于0.1mol/L的柠檬酸缓冲液中，临用前配制。

注射后72h血糖可稳定升高，有三多症状。

血糖在11.1mmol/L以上可作为成功模型选用。

造型时STZ应新鲜配制，分组时各组动物的平均血糖值相差不宜大于20mg/dl，血糖值升高不符合要求的动物应剔除。

（3）其它高血糖动物模型
可选用狗或家兔胰腺切除致糖尿病模型。

自发性糖尿病动物低血清胰岛素型可选用BB大鼠，NOD小鼠及中国地鼠；高血清胰岛素型可选用ob/ob小鼠、db/db小鼠、KK小鼠等，
这类动物多肥胖，有高胰岛素血症及胰岛素抵抗，类似人类2型糖尿病特点。

但要求饲养条件高，动物价格昂贵，难以推广。

在探讨糖尿病病因、病理生理学、分子生物学及抗糖尿病新药的进一步评价时，选用这类动物是有意义的。

另外，肾上腺素（ＡＤ）性高血糖模型常用小鼠或大鼠。

每只大鼠或小鼠按240μg/kg皮下注射ＡＤ。

其机制是ＡＤ进入体内促进肝脏及肌肉糖原分解，经三羧酸循环糖异生增快，并促进糖异生，导致血糖升高。

但该高血糖模型易恢复正常。

免疫性高血糖模型造型采用静脉注射抗胰岛素抗体或用同种或异种胰岛素的Freund’s佐剂复合物+抗血清免疫；或用同种或异种胰腺+Freund’s佐剂免疫动物，均可在数小时后产生一过性高血糖。

其机制是内源性胰岛素与输入的抗体结合导致内源性胰岛素降低而致糖尿病。

上述后2种模型由于与临床情况有一定差异，不太常用。

2、关于2型糖尿病动物模型的制备问题
目前最常应用的糖尿病动物模型不管是四氧嘧啶及STZ诱导的高血糖动物模型，还是手术切除胰腺的部分或全部，其机理都是引起胰岛素分泌的降低甚至缺失，与1型糖尿病的发病机理相似[3][4]。

虽然自发性糖尿病动物可有高胰岛素血症及胰岛素抵抗，类似人类2型糖尿病特点，但其较高的要求条件使其在药效学研究中的应用受到很大限制。

针对2型糖尿病的特点，目前有关2型糖尿病模型制备常采取下列方法[5][6][7]：
（1）大鼠喂以高糖高脂饲料(其中含10%蔗糖，10%猪油，5%胆固醇)一个月，诱发出胰岛素抵抗，继以低剂量STZ 25mg/kg，腹腔注射，诱发胰岛素代偿性分泌障碍，使之产生高血糖症。

该糖尿病模型具有中度高血糖，高血脂，高血压，血胰岛素不降低，胰岛素抵抗等特
点。

（2）给予新生鼠大剂量造成β细胞轻度损害，正常饲料喂养，9周后可出现体重无明显变化，饮水量和饮食量明显增多，空腹血糖、血清胰岛素水平正常，但口服葡萄糖耐量低下，胰岛素分泌低下，与2型糖尿病临床症状相符。

用STZ处理的新生大鼠成年后呈2型糖尿病表现。

（3）高脂饮食诱发2型糖尿病模型采用占摄入热卡61%的高脂饮食(主要是饱和脂肪酸的动物脂肪，其中蛋白质占19%，碳水化合物占20%，脂肪占61%)饲养动物7周后，大鼠可出现高胰岛素血症及胰岛素抵抗，血糖升高，小鼠体重超常，伴血脂异常等。

（4）下丘脑性糖尿病，用电凝法或注射硫代葡萄糖损伤丘脑下部腹内侧核（ＶＭＨ）饱中枢,可使成熟动物产生过度摄食、肥胖,直至产生糖尿病。

（5）自发性II型糖尿病动物模型。

该类模型是指实验动物未经任何有意识的人工处理，在自然的情况下发生糖尿病。

已用于研究的自发性糖尿病动物约20种，可分为两类：一类为缺乏胰岛素，起病快、症状明显，并伴有酮症酸中毒；另一类为胰岛素抵抗性高血糖症，其特点是病程长，不合并酮症。

后者为II型糖尿病模型。

3、模型选择的合理性
由于1型糖尿病患者发病率较低，且必须用胰岛素治疗，新药申报的适应症绝大多数是2型糖尿病。

这类药物申报资料中提供的药效学试验选用的动物模型大多是化学制剂诱导的与1型糖尿病类似的高血糖模型。

在病理生理方面，1型糖尿病的胰岛β细胞被破坏，导致胰岛素绝对缺乏；2型糖尿病则以胰岛素抵抗为主伴胰岛素缺乏[8]。

选用模型不当对正确评价
药物有效性有很大影响。

因此，申报糖尿病治疗的药物应结合所拟定的功能主治复制合适的动物模型，或者以1型糖尿病类似的动物模型为主，或者以2型糖尿病类似的动物模型为主进行药效学试验。

4、其它
应根据受试药物的药理作用特点选择不同的试验方案，如能够促进胰岛β细胞分泌胰岛素，应测定血清胰岛素水平，可以选择正常动物但不能选择化学制剂诱发的高血糖动物模型进行试验；如有糖水解酶抑制剂样作用者应进行淀粉或蔗糖等双糖的糖耐量试验；如有胰岛素增敏作用，则应观察与胰岛素合用的增效作用。

另外，药效学研究也可结合体内实验进行一些糖尿病的离体试验，如分离、培养脂肪细胞、胰岛细胞进行有关糖代谢试验。

在阳性药选择上，不少申报单位选择作用机制明确的化药，应注意阳性对照药的合理性。

如正常动物及某些自发性高血糖动物可选用磺酰脲类；化学制剂诱导的高血糖模型可选用双胍类，有糖水解酶抑制剂样作用者应选择糖水解酶抑制剂作为对照药物。

总之，结合受试药物的作用特点、拟定适应症制备合适的动物模型，选择合理的观察指标，充分探讨、论证其有效性，为临床研究提供有效性依据，是临床前药效学试验的最终目的。

为达到这一目的所进行的所有依据充分的、有客观参考价值的研究工作都是有意义的。

参考文献
[1] 向红丁.糖尿病的流行病学、诊断分型及防治原则.中华医学信息导报.2004，19（5）：18-19
[2] 严桂民.II型糖尿病的最新研究进展.中华医学丛刊.2003；3（6）：3-5
[3] 嵇扬，张癸荣，王文俊.建立四氧嘧啶糖尿病模型的研究.中医药学刊.2003；21（7）：1125-1126
[4] 刘学政，萧鸿.链脲佐菌素致大鼠糖尿病模型的研究.锦州医学院学报.2001；22(4)：11-14
[5] 张亚非.II型糖尿病实验模型.国外医学卫生学分册.2000；27（6）：328-331
[6] 周敏，柴可夫.实验性2型糖尿病动物模型研究及其进展.浙江中医学院学报.2001；25（5）：79-81
[7]张芳林，李果，刘优萍，等.2型糖尿病大鼠模型的建立及其糖代谢特征分析.中国实验动物学报.2002；10（1）16-20
[8] 王军，李利，董砚虎.胰岛B细胞的病理生理与胰岛素抵抗研究进展.国外医学内分泌学分册.2002；22（2）：119-122。