谷氨酸棒状杆菌高效发酵谷氨酸的关键分子机理研究进展

谷氨酸棒状杆菌高效发酵谷氨酸的关键分子机理研究进展杨阳;张苗苗;高越;郭晓鹏;李文建;冷非凡;陆栋

【摘要】谷氨酸是世界上产量最大的氨基酸,在食品、医药、工农业等领域具有广泛的用途.谷氨酸棒状杆菌是工业生产谷氨酸的主要菌株,从发现谷氨酸棒状杆菌以来,国内外在谷氨酸过量产生机理方面的研究已取得了一定的科研成果.本文就发酵过程中基因转录水平、关键酶酶活、细胞膜与运输蛋白的结构3个层面机理的研究进展做一综述.最后对谷氨酸过量产生的机理进行分析,将来需从生理作用及调控因子等方面研究,进一步完善谷氨酸过量产生机理,以期对提高谷氨酸产量以及开发微生物合成其他生物产品提供参考和方向.

【期刊名称】《食品工业科技》

【年(卷),期】2019(040)005

【总页数】6页(P311-315,321)

【关键词】谷氨酸棒状杆菌;谷氨酸发酵;分子机理

【作者】杨阳;张苗苗;高越;郭晓鹏;李文建;冷非凡;陆栋

【作者单位】兰州理工大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730050;中国科学院近代物理研究所,甘肃兰州730000;中国科学院近代物理研究所,甘肃兰州730000;甘肃省微生物资源开发利用重点实验室,甘肃兰州730070;中国科学院近代物理研究所,甘肃兰州730000;中国科学院近代物理研究所,甘肃兰州730000;中国科学院近代物理研究所,甘肃兰州730000;甘肃省微生物资源开发利用重点实验室,甘肃兰州730070;兰州理工大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730050;中国科学院近代物

理研究所,甘肃兰州730000;甘肃省微生物资源开发利用重点实验室,甘肃兰州730070

【正文语种】中文

【中图分类】TS201.1

谷氨酸是食物蛋白质的重要组成,在营养代谢、能量供应、免疫响应、氧化应激及

信号通路调节等过程中发挥重要作用[1]。因此,谷氨酸作为一种重要氨基酸被广泛

应用于食品、饲料、医药、化妆品等行业。谷氨酸是由α-酮戊二酸与游离氨在谷

氨酸脱氢酶的催化下发生还原氨基化而形成。已经证实大肠杆菌突变菌株(E. coli)

及芽孢杆菌属(Bacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、链霉菌属(Streptomyces)和

棒状杆菌属(Corynebacterium)中有许多菌株能生产谷氨酸,其中谷氨酸棒状杆菌

是研究和应用最多的谷氨酸生产菌[2]。

谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)是一种好氧型的、非致病革兰氏阳性菌,它是一种重要的工业微生物,用来发酵生产 L-谷氨酸,其它氨基酸及各种有机酸[2]。谷氨酸产生菌大多为生物素缺陷型,因此在谷氨酸发酵时通过控制生物素亚

适量,引起代谢失调,使谷氨酸得以积累[3]。在利用木质纤维素水解产物作为原料发酵生产谷氨酸时(如稻草、小麦秸秆、甘蔗渣),需要克服过量生物素对谷氨酸分泌产生的抑制作用,在发酵过程中适时适量添加吐温40(Tween 40)或青霉素等诱导物可有效提高谷氨酸产量[4]。谷氨酸合成途径包含大量复杂的酶反应,包括糖酵解途径(glycolytic pathway,EMP)、磷酸己糖途径(pentose phosphate pathway,PPP)、三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle,TCA)、乙醛酸循环(glyoxylic acid

cycle,GAC)、伍德-沃克曼(Wood-Werkman cycle)反应等。由于谷氨酸合成分解代谢途径比较复杂,影响其合成和分解代谢的因素也会较多,对谷氨酸合成机理的研

究造成了一定困难,一直以来在其合成代谢途径中的酶、基因等许多因素的作用和功能不明确。

近年来随着分子生物学的快速发展,分子生物学技术在谷氨酸研究领域的应用越来越广泛,大量合成谷氨酸的新机理被不断揭示,包括诱导物触发谷氨酸的分泌都伴同α-酮戊二酸脱氢酶复合物(α-oxoglutarate dehydrogenase complex,ODHC)酶活的显著降低与细胞膜通透性的增加,从而引起代谢流的方向变化并激活谷氨酸运输蛋白,最终影响谷氨酸的合成。本文综述了近年来有关谷氨酸合成与分泌机理的研究进展,以期对未来开发微生物合成谷氨酸及其它生物产品提供参考和方向。

1 转录水平调控谷氨酸积累

1.1 中心代谢途径相关酶转录水平

合成谷氨酸的代谢途径至少有16步酶促反应,其中任意一个酶转录水平的变化都可能引起代谢流走向的改变,影响谷氨酸的合成。Hirasawa等[5]利用代谢组学和转录组学技术研究发现,在发酵途中添加青霉素后,10～360 min细胞内含有的20种氨基酸的含量均下降,有四个可能与谷氨酸分泌相关的信号转导基因转录水平上调,戊糖磷酸途径相关基因转录水平下调,三羧酸循环与糖酵解途径中有关葡萄糖转化为α-酮戊二酸的基因转录水平上调,α-酮戊二酸转化为草酰乙酸的基因与补给途径相关基因转录水平下调。此外,NCgl1221与odhI分别编码谷氨酸运输蛋白与ODHC抑制蛋白,它们的转录水平上调。这些实验结果表明青霉素引起的细胞代谢变化和谷氨酸的分泌,是代谢途径中相关酶的转录水平改变触发的。曹艳[6]通过关键酶的转录水平分析,进一步阐明转录水平与谷氨酸大量积累的内在关系,生物素充足时,添加Tween 40能够提高胞内催化所有的代谢途径关键酶的转录水平,并诱导了细胞转型使细胞膜(壁)结构发生改变、通透性增加。胞内谷氨酸含量升高,运输蛋白的转录水平也大幅提高促使谷氨酸分泌,最终使发酵液中谷氨酸浓度达到正常水平。Kataoka等[7]通过DNA芯片技术研究发现,生物素限量、初始生物素过量在

发酵途中添加青霉素或Tween 40,可以降低α-酮戊二酸脱氢酶复合物的活性,从而改变代谢流的流向使谷氨酸大量合成,该酶由α-酮戊二酸脱氢酶(α-ketoglutarate decarboxylase,E1)、二氢硫辛酰转琥珀酰酶(dihydrolipoamide succinyltransferase,E2)和二氢硫辛酰脱氢酶(dihydrolipoamide dehydrogenase,E3)三种酶组成。α-酮戊二酸脱氢酶复合物酶活性降低是由编码E1的基因odhA和E2的基因sucB转录水平下调所致。此外,还有5个目前未知功能的可能与谷氨酸大量合成相关的基因显著上调(NCgl0917、NCgl2944、NCgl2945、NCgl2946和NCgl2975),涉及EMP、PPP和TCA途径的大多数基因下调,这些结果表明,谷氨酸的大量产生与细胞中已有的酶密切相关。

1.2 能量代谢及分支菌酸缺失株基因转录水平

细胞内能量水平对糖代谢相关酶、ATP依赖型的运输系统有调控作用,因此,能量代谢可能会影响谷氨酸的合成与积累。Sekine等[8]发现一株带有自发新霉素突变的谷氨酸棒状杆菌,对葡萄糖的消耗比率较亲本菌株高2倍,但其生长率比亲本菌株低,且H+-ATPase 活性降低了25%。进一步研究发现,在H+-ATPase 的γ亚基基因序列中有一个点突变。后经发酵条件优化,该菌株的谷氨酸产量提高一倍以上[9]。利用H+-ATPase基因失活构建高产谷氨酸基因工程菌,证实了H+-ATPase基因失活对提高谷氨酸产量的作用[10]。Hirasawa等[5]在转录组测序的基础上,通过差异基因功能富集分析,发现青霉素诱导谷氨酸分泌时与能量合成、转换的相关基因转录水平显著下调,编码F1F0-ATPase的基因转录水平下调。以上结果表明,谷氨酸的大量分泌可能与细胞内能量合成与转化的基因转录水平下调有关系。

细胞壁对氨基酸的分泌具有渗透屏障的作用,同时分枝菌酸是谷氨酸棒状杆菌细胞壁非常重要的组分。为了探究分枝菌酸的功能和分支菌酸缺失对细胞造成的影响,高云飞[11]构建了C.glutamicum ATCC13869的分枝菌酸缺失株,发现其合成和分泌谷氨酸的能力显著提高;随后通过转录组对比分析分枝菌酸缺失株和原始株,共