小麦TaYAB2基因的过量表达造成转基因拟南芥叶片近轴面特征趋向远轴面

小麦TaYAB2基因的过量表达造成转基因拟南芥叶片近轴面
特征趋向远轴面
赵翔宇;谢洪涛;陈祥彬;王帅帅;张宪省
【摘要】叶片极性的建立在叶片形态建成过程中有重要作用.探讨小麦叶片发育的调控机制不仅可以丰富植株形态建成的基础知识,也可以为小麦株型的设计提供理
论依据.本研究从小麦中分离出一个YABBY基因家族成员TaYAB2,对其序列特征、表达模式及功能进行了分析.该基因编码的蛋白在N端含有C2C2锌指结构域, C
端含有YABBY结构域,与拟南芥中AtYAB2和水稻中OsYAB2同源关系较近.RT-PCR结果显示,该基因在大部分组织器官中广泛表达.进一步的原位杂交分析证实TaYAB2基因的转录产物在小麦苗端、幼叶、侧芽、幼穗等组织器官中高水平积累.在拟南芥中过量表达该基因能够引起转基因拟南芥叶片近轴面特征趋向远轴面.与
对照相比,转基因植株中远轴面特征决定基因FIL/YAB1、YAB3、KAN1的表达均
呈不同程度的上调,表明TaYAB2基因可能通过调节远轴面特征决定基因FIL/YAB1、YAB3、KAN1等调控叶片近-远轴极性.本研究结果有助于揭示YABBY类基因在小麦侧生器官近-远轴极性建立中的分子机制.%10.3724/SP.J.1006.2012.02042
【期刊名称】《作物学报》
【年(卷),期】2012(000)011
【总页数】10页(P2042-2051)
【关键词】近-远轴极性;叶片发育;TaYAB2;小麦;转基因
【作者】赵翔宇;谢洪涛;陈祥彬;王帅帅;张宪省
【作者单位】山东农业大学生命科学学院/山东省作物生物学重点实验室/作物生物学国家重点实验室, 山东泰安 271018;山东农业大学生命科学学院/山东省作物生物学重点实验室/作物生物学国家重点实验室, 山东泰安 271018;山东农业大学生命科学学院/山东省作物生物学重点实验室/作物生物学国家重点实验室, 山东泰安271018;山东农业大学生命科学学院/山东省作物生物学重点实验室/作物生物学国家重点实验室, 山东泰安 271018;山东农业大学生命科学学院/山东省作物生物学重点实验室/作物生物学国家重点实验室, 山东泰安 271018
【正文语种】中文
叶是植物的重要营养器官之一, 是植株形态建成的重要组成部分, 对植株生长发育有着重要的意义[1]。

在植物发育生物学研究中, 极性建立过程是器官形态建成中的一个核心问题。

为了研究叶片极性建成的机制, 根据叶原基与茎尖分生组织(shoot apical meristem, SAM)的相对位置关系, 科学家定义了叶在空间三维轴向上的极性, 包括基-顶轴(proximaldistal axis)、中-侧轴(medial-lateral axis)和近-远轴(adaxial-abaxial axis)[2-4]。

叶片近-远轴极性的正确建立是叶其他 2个轴向极性建立的前提和后续形态建成的基础[5-7]。

利用模式植物特别是拟南芥(Arabidopsis thaliana L.), 已发现多个转录因子在叶片近-远轴极性建成过程中具有重要作用。

其中, 促进叶片近轴面特征建成的转录因子基因包括ASYMMETRIC LEAVES 1(AS1)、AS2以及HD-ZIP III家族的REVOLUTA (REV)、PHABULOSA (PHB)和 PHAVOLUTA (PHV)[8-10], 而KANADI (KAN)和 YABBY (YAB)转录因子家族成员及生长素响应因子(auxin response factor, ARF)家族的ETT/ARF3和ARF4促进叶片远轴面特征的建成[11-15]。

YAB基因家族是一类植物特有的基因家族,其成员具有C2C2锌指结构域
及YABBY结构域, 在YABBY区域的氨基酸残基具有很大的保守性, 而在锌指结构
域与 YABBY结构域之外的区域几乎不具有序列同源性, 不同的成员具有不同的表
达特异性[11,16-17]。

研究表明, YABBY蛋白定位于细胞核内[17-19]。

在拟南芥
基因组中有6个YABBY基因家族成员, 分别是 FILAMENTOUS FLOWER
(FIL/YABBY1)、CRABS CLAW (CRC)、INNER NO OUTER (INO)、YABBY2 (YAB2)、YAB3 和 YAB5 [11,16-17,20-21]。

FIL/YAB1、YAB2和YAB3在叶片
的远轴面表达, fil yab3双突变体的叶很狭窄且远轴面的表皮细胞会有近轴面特征
的表皮细胞镶嵌, FIL和YAB3过量表达的植株会产生远轴面化的叶片[11], 表明
FIL和YAB3促进叶片远轴面特征建成。

YABBY基因还调控叶片的扩展。

fil yab2 yab3 yab5的四突变体尽管还具有部分近-远轴极性的分化, 但叶片边缘细胞缺失, 叶片不能扩展而成为辐射对称的器官[22]。

尽管拟南芥YABBY基因与远轴面的特
征建成相关, 但在单子叶植物玉米中却在叶片近轴面表达[23]。

水稻中8个YABBY 基因被先后克隆并研究了其表达模式[24]。

尽管 OsYAB1是DROOPING LEAF (DL)拟南芥YAB2和CRC的同源基因, 但是它们在侧生器官中呈非极性模式表达[19,25],并且在水稻中异位表达OsYAB1或DL都没有引起近-远轴极性的变化。

最近研究发现, DL基因促进水稻主脉的形成[26]。

这表明YABBY基因的表达和功能在物种间可能并不完全保守, 在单、双子叶植物间发生了分歧。

小麦是一种重要的禾本科作物, 其叶片形态不同于拟南芥, 探讨其叶片发育的调控
机理不仅可以丰富植株形态建成的基础知识, 也可以为小麦株型的设计提供理论依据。

目前, 在小麦中克隆到调控叶片极性建成的基因有 TaYAB1和 TaCRC [27-28]。

TaYAB1基因在拟南芥中异位表达影响了叶片近-远轴极性的建成, 使叶片近轴面特征趋向远轴面[28]。

为更进一步理解小麦叶片极性建成的机制, 我们克隆了小麦中
另一个YABBY基因家族成员TaYAB2 (Triticum aestivum YABBY2)。

该基因在
拟南芥中过量表达也造成叶片极性的变化, 使叶片近轴面特征趋向远轴面。

这些结
果为深入理解小麦叶片发育提供了新的资料。

1 材料与方法
1.1 植物材料
小麦(Triticum aestivum L.)品种小偃6号在光照培养箱[(22±1)℃, 16 h光/8 h暗]中萌发生长或者种植于山东农业大学实验网室。

拟南芥(A. thaliana L.)生态型为Columbia (Col)。

种子经75% (V/V)乙醇消毒5 min, 2.6% (V/V)NaClO消毒10 min, 播种于GM培养基(1/2 MS无机盐, 1%蔗糖, pH 5.7)。

4℃暗处理3 d后移
至长日照(23℃, 16 h光/8 h暗)条件下萌发5～7 d, 然后将幼苗移到蛭石中, 在相同长日照条件下生长。

1.2 TaYAB2基因的克隆及载体构建
取小麦幼叶为材料, 利用Trizol试剂(Invitrogen)提取总RNA, 反转录合成cDNA。

以此为模板, 利用特异引物 TaYAB2-CF (5′-CTTCTTTCGTCTTCCTC ATCCTCT-3′)和 TaYAB2-CR (5′-GCAATCAACTGGG TAAAAAATGTA-3′)扩增TaYAB2基因的全长cDNA序列。

扩增条件为94℃预变性3 min; 94℃变性1 min,56℃退火1 min, 72℃延伸1 min, 35个循环; 最后72℃后延伸 10 min。

将 TaYAB2基因的
全长 cDNA克隆到克隆载体pMD-18T Vector (TaKaRa)中, 由生工生物工程(上海)有限公司测序正确后, 经Xba I和Sal I酶切后正向插入表达载体pBI121中35S
启动子下游, 获得正义的35S::TaYAB2表达载体。

1.3 TaYAB2基因的表达模式分析
1.3.1 RT-PCR 取小麦幼根、茎、幼叶、旗叶、茎尖和幼穗, 提取总 RNA, 反转录合成 cDNA。

用TaYAB2基因的半定量特异引物进行 RT-PCR扩增,检测其在小麦不同组织内的表达。

扩增引物为TaYAB2-F1: 5′-CTTCTTTCGTCTTCCTCATC-3′和TaYAB2-R1: 5′-CCTTCGTATCTCCTCCTTA-3′。

扩增条件为94℃预变性3 min; 94℃变性1 min, 56℃退火1 m in, 72℃延伸1 min, 30个循环; 最后72℃后延伸
10 min。

内参基因 TaActin的引物为 TaActin-F:5′-ATCATCCTGTGTTGCTGAC-3′和 TaActin-R: 5′-A TGGTAGAACCTCCACTGAG-3′。

扩增条件为94℃预变性3 min; 94℃变性1 min, 58℃退火1 min, 72℃延伸1 min, 28个循环; 最后72℃后延伸10 min。

1.3.2 mRNA原位杂交参照 Zhao等[29]报道的方法, 分别取萌发后 4周的小麦幼苗苗端、侧芽及幼穗, 用新鲜FAA固定液(50%乙醇∶10%冰醋酸∶5%甲醛)固定, 4℃过夜; 经脱水、透明后将材料包埋于石蜡(Sigma-Aldrich)中, 接着用切片机(American Opitcal 820 Rotary, 美国)切片(8 μm 厚), 并粘到载玻片上(Poly-Prep Slides, Sigma-Aldrich)。

选取 TaYAB2基因cDNA的3′端非编码区(300 bp)为模板, 利用探针合成试剂盒 DIG RNA labeling kit (Boehringer Mannheim)转录合成 TaYAB2基因的原位杂交 RNA探针。

令植物切片在含有200 ng mL−1探针的杂交液中42℃杂交过夜。

利用DIG nucleic acid detection kit(Boehringer Mannheim)检测信号。

用Olympus BH-2型显微镜观察照相。

1.4 TaYAB2基因异源转化拟南芥及鉴定
以35S::TaYAB2表达载体质粒转化根癌农杆菌GV3101, 拟南芥花絮浸染法遗传转化拟南芥(Col)[30]。

将转化后收获的种子在含有50 mg L−1卡那霉素(kanamycin)的抗性琼脂糖平板上筛选抗性苗, 并将其移植于蛭石中生长。

利用基因组提取试剂盒(Qiagen)提取抗性植株叶片的基因组DNA, 用TaYAB2-CF 和TaYAB2-CR引物进行PCR鉴定。

用Trizol法提取鉴定出阳性植株的总RNA, 反转录为cDNA, 用半定量RT-PCR法检测 TaYAB2基因在不同拟南芥转基因株系中的表达水平。

TaYAB2基因的半定量引物及扩增条件同RT-PCR实验。

1.5 转基因植株表型分析
参照 Zhao等[28]报道的方法以扫描电镜观察35S::TaYAB2转基因植株及野生型植株莲座叶片表面。

利用石蜡切片法[28]分析35S::TaYAB2转基因拟南芥及对照
的叶片和茎尖组织形态结构。

以 35S::TaYAB2转基因植株和野生型对照各 50株为群体,分别统计长日照下(16 h/8 h)植株抽薹的时间及开花时莲座叶的数目, 作图比较所得数据平均值。

1.6 以RT-PCR检测转基因拟南芥中叶片发育相关基因的表达
采用Trizol试剂盒提取转基因拟南芥12 d幼苗的总RNA, 反转录合成cDNA, 采用半定量RT-PCR检测转基因拟南芥叶片发育相关基因的表达水平, 包括
FIL/YAB1 (F: 5′-GCTATGTCCAATGCAACTTT-3′, R:5′-TTCTTGGCAGCAGCACTAAA-3′)、YAB3 (F: 5′-A CTTCTCATCTACGGACCAG-3′, R: 5′-TCAGCCATG AGTCCAAAGTG-3′)、YAB5 (F: 5′-CTTGTTTGGTCC TATTTCTC-3′, R: 5′-TTCACTTACATACATACGGTT C-3′)、KAN1 (F: 5′-ACAACAACGCTTACCGATCA-3′, R: 5′-ATTTCTCGTGCCAATCTGGT-3′)、KAN2 (F:5′-TCATGCCAAGATTCCCAG-3′, R: 5′-TTAGTGAG ATCGACCCAGAG-3′)和AS1 (F: 5′-AGAGTTGAGC CTATTGACGA-3′, R: 5′-AGTAAACATTGGAGAC ACCC-3′)。

扩增条件为94℃预变性3 min; 94℃变性1 min, 56℃退火1 min, 72℃延伸1 min, 30个循环;最后72℃后延伸10 min。

以AtTubulin基因(F: 5′-G CCAGATGCCGAGTGACAAG-3′, R: 5′-AGGCTCA ACAACGGAGGTAG-3′)为内参对照, 扩增条件为94℃预变性3 min; 94℃变性1 min, 58℃退火1 min,72℃延伸1 min, 28个循环; 最后72℃后延伸10 min。

2 结果与分析
2.1 小麦TaYAB2基因的克隆与序列分析
以小麦叶片为材料, 利用RT-PCR方法得到989 bp的基因片段, 命名为TaYAB2 (GenBank登录号为ABW80974)。

TaYAB2 cDNA包含555 bp的开放阅读框架, 由此推测 TaYAB2蛋白含有 185个氨基酸残基(图1)。

预测该蛋白分子量为20 998.57 Da, 等电点为 9.42。

其氨基酸序列具有典型的 YABBY家族特征[31], 即 N
端含有 C2C2锌指结构域(C2C2 zinc finger domain), C端含有YABBY结构域(YABBY domain)(图2)。

比较TaYAB2蛋白的氨基酸序列与GenBank中所有氨基酸序列, 结果显示 TaYAB2蛋白与单子叶植物水稻(Orzya sativa)中的OsYABBY2蛋白(84%)以及双子叶植物拟南芥中的 AtYABBY5蛋白(53%)和AtYABBY2蛋白(53%)同源性较高(图2)。

多序列一致性比对结果显示, 同源区域都集中在 N端锌指结构域和C端YABBY结构域(图2)。

TaYAB2基因与小麦中TaYAB1基因的DNA序列和氨基酸序列的同源性分别为37%和32%。

为进一步确定TaYAB2与其他植物中YABBY同源基因的亲缘关系, 利用DNAMAN软件包中的NASED软件, 采用Neighbor-Jointing方法构建YABBY 蛋白的系统进化树(图3)。

显示TaYAB2蛋白与水稻OsYABBY2蛋白亲缘关系最近, 而与小麦 TaYAB1[28]和TaCRC[27]亲缘关系相对较远。

2.2 小麦TaYAB2基因的表达模式分析
图1 TaYAB2基因全长cDNA的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列Fig. 1 The nearly full-length nucleotide sequence of TaYAB2 cDNA and its deduced amino acid sequence星号表示终止密码子, 单下画线区域表示5′端非编码区域; 双下画线区域表示3′端非编码区域。

The asterisk represents stop codon; the single-lined region and the double-lined region are 5′-end untranslated region and 3′-end untranslated region, respectively.
利用特异引物 TaYAB2-F1和 TaYAB2-R1进行RT-PCR分析, 在根中未检测到TaYAB2的表达, 而在其他组织中有不同程度的表达(图4-a)。

利用原位杂交技术进一步分析 TaYAB2基因转录产物的细胞定位, 在苗端、幼叶、侧芽及幼穗中都检测到该基因的转录产物(图4-b～e, g), 而且转录产物的分布不呈现典型的极性模式。

这些结果说明, TaYAB2基因在小麦中表达范围非常广泛。

2.3 小麦TaYAB2基因的功能分析
利用卡那霉素抗性筛选, 得到 32株转 TaYAB2基因的拟南芥抗性苗, 经PCR鉴定
确认为阳性转基因植株(图5-e)。

RT-PCR结果显示TaYAB2基因在转基因拟南芥
植株中超量表达(图 5-f)。

抗性植株均为阳性转基因植株, 并且出现叶片卷曲的表型。

野生型拟南芥的莲座叶片呈卵圆形并且表面比较平坦(图5-a, c), 然而
35S::TaYAB2转基因植株的莲座叶片狭长并且显著地向远轴面翻卷(图5-b, d)。

扫描电镜观察发现野生型莲座叶的近轴面比较平坦(图 6-a), 表皮细胞大小相同(图 6-b), 并且其气孔密度较小(图6-b), 但远轴面表皮细胞大小不同(图6-c,d), 气孔密度
较大。

与之相比, 转基因植株莲座叶的近轴面不平坦(图 6-e), 具有大小不同的表皮细胞和较多的气孔(图6-f)。

这表明在35S::TaYAB2转基因植株莲座叶的近轴面,
表皮细胞的特征部分趋向于野生型莲座叶的远轴面。

图2 TaYAB2蛋白与水稻(Oryza sativa)的OsYABBY2蛋白和拟南芥(Arabidopsis thaliana)的YAB2和YAB5蛋白的序列比较Fig. 2 TaYAB2 is compared with putative YABBY proteins from rice (OsYABBY2), and Arabidopsis (YAB2 and YAB5)黑色的部分表示相同的氨基酸残基, 灰色的部分表示相似的氨基酸残基。

圆点代表同源比较中软件自动引入的空隙。

单下画线区域表示C2C2锌指结构域, 双下画线区域表示YABBY结构域。

Dark shading with white letters and gray shading with dark letters indicate 100% and 75% sequence conservation, respectively. Dots denote gaps introduced by the alignment program. The single-underlined region is the C2C2 zinc finger-like domain and the double-underlined region is the YABBY domain.
图3 TaYAB2的系统进化树Fig. 3 Phylogenetic tree of TaYAB2小麦(Triticum aestivum)TaYAB2 (ABW80974, 方框)、TaYAB1(AAQ93323, 下画线)和 TaCRC (AAQ11881)蛋白, 拟南芥(Arabidopsis thaliana)YAB1 (AAC69834)、YAB2 (AEE28295)、YAB3 (AEE81835)、YAB5 (AEC07861)、INO (AEE30385)和
CRC(AEE34891)蛋白, 水稻(Oryza sativa)OsYABBY1 (BAF45802)、OsYABBY2 (BAF45803)、OsYABBY3 (BAF45804)、OsYABBY4(BAF45805)、OsYABBY5 (BAF45806)、OsYABBY6 (BAF45807)和OsYABBY7 (BAF45808)蛋白, 玉米(Zea mays)ZYB9(AAP79886)、ZYB10 (AAP79887)和 ZYB14 (AAP79884)蛋白, 金鱼草(Antirrhinum majus)AmCRC (AAS10180)、AmYABBY1(AAS10178)、AmYABBY2 (AAS10179)和 AmINOL (AAS10181)蛋白, 烟草(Nicotiana tabacum)NtCRC (AAW83046)蛋白, 无油樟(Amborella
trichopoda)AmtYABBY2 (BAD72168)蛋白之间的进化关系。

进化树由DNAMAN 4.0 (Lynnon BioSoft company,USA)生成。

分支线长度表示蛋白之间差异的变化范围。

Phylogenetic relationship among TaYAB2 (ABW80974, boxed),TaYAB1 (AAQ93323, underlined), and TaCRC (AAQ11881)in wheat (Triticum aestivum), YAB1 (AAC69834), YAB2 (AEE28295),YAB3 (AEE81835), YAB5 (AEC07861), INO (AEE30385), and CRC (AEE3489)in Arabidopsis thaliana, OsYABBY1 (BAF45802),OsYABBY2 (BAF45803), OsYABBY3 (BAF45804), OsYABBY4(BAF45805), OsYABBY5 (BAF45806), OsYABBY6 (BAF45807),and OsYABBY7 (BAF45808)in rice (Oryza sativa),
ZYB9(AAP79886), ZYB10 (AAP79887), and ZYB14 (AAP79884)in maize (Zea mays), AmCRC (AAS10180), AmYABBY1(AAS10178), AmYABBY2
(AAS10179), and AmINOL (AAS10181)in snapdragon (Antirrhinum majus), NtCRC (AAW83046)in tobacco (Nicotiana tabacum), and AmtYABBY2 (BAD72168)in Amborella trichopoda. The phylogenic tree was generated using DNAMAN 4.0 (Lynnon BioSoft company, USA). The length of the branch line indicates the extent of difference according to the scale at upper left.
对转基因植株的莲座叶片的切片观察结果显示,野生型叶片中的叶肉细胞分化均有明显的极性, 在近轴面为排列紧密的圆柱状栅栏组织细胞, 这些细胞呈长方柱紧密排列, 细胞间隙很小, 而远轴面则分布着排列疏松的、近球形的海绵组织细胞, 细胞间隙比较大(图6-k)。

35S::TaYAB2转基因植株叶片的内部组织极性分化出现异常, 近轴面表皮内方的细胞排列不再紧密, 形状不规则, 类似于海绵组织细胞(图6-l)。

此外, 35S::TaYAB2转基因植株的苗端分生组织也发生了变化。

野生型拟南芥的苗端分生组织呈半球型(图6-m), 转基因植株的苗端分生组织比较扁平, 已不具有明显的半球型(图 6-n)。

这说明TaYAB2的过量表达可能对苗端分生组织的形成产生一定的影响。

2.4 小麦TaYAB2基因的过量表达影响了转基因拟南芥中叶片极性分化相关基因的表达
YAB和 KAN转录因子家族成员促进叶片远轴面特征的形成[11-13,32]。

在35S:: TaYAB2转基因植株的叶片中, FIL/YAB1和YAB3的表达水平均得到提高,而YAB5基因的表达变化不明显。

KAN基因家族中的KAN1的表达量明显上调, 而KAN2变化不明显。

另外, 在转基因植株中叶片近轴面特征决定基因AS1的表达却没有明显变化(图7)。

这表明可能是TaYAB2基因通过促进叶片远轴面特征决定基因的表达引起了叶片极性的变化。

2.5 小麦TaYAB2基因过量表达延迟转基因拟南芥的抽薹时间
TaYAB2基因过量表达不仅影响转基因拟南芥叶片的近-远轴极性, 而且还略微延迟转基因拟南芥的抽薹时间。

长日照条件下野生型拟南芥在播种后28 d开始抽薹, 而转基因拟南芥植株则在33 d时才开始抽薹(图8-a)。

由于在固定的生长条件下拟南芥抽出花序时的莲座叶数目是固定的, 所以通常以莲座叶的数目作为比较拟南芥开花时间的指标。

抽薹时, 转基因植株的莲座叶数(13.20±0.55)多于野生型对照的莲座叶数(11.17±0.41)(图8-b), 进一步表明, 35S::TaYAB2转基因植株的抽薹时
间晚于野生型对照。

3 讨论
近-远轴极性的建立是植物侧生器官形态建成的重要方面, 拟南芥中 YABBY家族成员在侧生器官近-远轴极性建立中是决定远轴面特征的重要因子[4,31]。

目前已从
水稻、百合、花菱草(Eschscholzia californica)等植物中分离出YABBY基因家族
成员, 表明YABBY基因广泛存在于单、双子叶植物中[24,28,33-36]。

图4 TaYAB2基因在小麦中的表达模式分析Fig. 4 Expression patterns of TaYAB2 in wheat(a)以RT-PCR分析TaYAB2基因在小麦的根(R)、茎(S)、幼叶(YL)、旗叶(FL)、茎尖分生组织(SAM)和幼穗(YE)中的表达。

TaActin基因作为内
参对照。

(b～e)和(g)TaYAB2基因转录物在苗端、侧芽和幼穗等器官中的细胞定位。

(f)正义探针对照。

(b)苗端的横切面; (c)和(f)苗端的纵切面; (d)侧芽横切面; (e)侧芽纵切面; (g)幼穗纵切面。

CL: 胚芽鞘; L: 叶; SAM: 苗端分生组织; SP: 幼穗原基。

bar =15 μm。

(a)Detection of TaYAB2 expression in roots (R), stems (S), young leaves (YL), flag leaves (FL), shoot apical meristems (SAM), and young ears (YE)of wheat by RT-PCR. TaActin was used as a control. (b–
e)and (g)Localization of TaYAB2 transcripts in SAM, lateral bud, and young spike. Sections in (b–e)and (g)were hybridized with the TaYAB2 antisense mRNA probe, and the section in (f)was used as a control with sense probe.
(b)Transverse sections of shoot apex; (c)and (f)Longitudinal sections of shoot apex; (d)Transverse sections of lateral bud;(e)Longitudinal sections
of lateral bud; (g)Longitudinal sections of young spikelet. CL: coleoptile; YL: young leaves; SAM: shoot apical meristem; SP: spikelet primordia. Bar = 15 μm.
图5 35S::TaYAB2转基因拟南芥表型分析Fig. 5 Phenotypic analysis of
35S::TaYAB2 transgenic Arabidopsis plants(a)野生型拟南芥植株; (b)转基因拟南芥植株; (c)野生型拟南芥莲座叶片近轴面(AD, adaxial surface)和远轴面(AB, abaxial surface);(d)转基因拟南芥莲座叶片近轴面(AD)和远轴面(AB); (e)转基因植株中TaYAB2基因在基因组水平的PCR鉴定, 1: 阴性对照, 2:质粒阳性对照, 3, 5, 6: 不同转基因株系, 4: DL15000; (f)转基因植株中TaYAB2基因的转录水平检测, 1: DL2000, 2: 野生型拟南芥, 3～5: 不同转基因株系。

(a)Wild-type seedlings. (b)35S::TaYAB2 transgenic seedlings. (c)Adaxial surface (AD)and abaxial surface (AB)of wild-type rosette leaves. (d)Adaxial surface (AD)and abaxial surface (AB)of 35S::TaYAB2 transgenic rosette leaves. (e)PCR profile of TaYAB2 in genome of transgenic plants. 1: negative control; 2: positive control; 3, 5, and 6: different transgenic plants; 4: DL15000. (f)TaYAB2 expression in transgenic plants. 1: DL2000; 2: wild type plant; 3–5: different transgenic plants.
我们从小麦中分离出一个不同于 TaYAB1[28]的YABBY基因, 定名为TaYAB2。

该基因编码的氨基酸序列中在N端含有一个锌指结构域, 在C端含有一个YABBY结构域。

TaYAB2氨基酸序列与拟南芥基因家族成员 AtYABBY2和水稻中OsYABBY2氨基酸序列的同源性较高(图2)。

这表明在不同植物中YABBY家族成员的锌指结构域与YABBY结构域是高度保守的。

TaYAB2与TaYAB1基因间核苷酸和氨基酸序列同源性很低。

同时, TaYAB2与TaYAB1不在系统进化树的同一个分支上(图3), 说明其进化关系较远, 2个蛋白的编码基因可能有较大区别。

双子叶植物拟南芥的叶片具有明显的栅栏组织与海绵组织, 属于两面叶。

然而单子叶植物小麦的叶片没有明显的栅栏组织与海绵组织的分化, 属于等面叶。

尽管单子叶植物在叶片形态和结构的很多方面不同于双子叶植物, 但是叶片发育的某些遗传途径是可以互换的[37]。

比如, 拟南芥中 AS1和玉米中ROUGH SHEATH2 (RS2)
同属于一类参与叶片发育调控的特异MYB-related基因家族[38-41]。

RS2的组
成型表达足以互补 as1突变体的表型, 这表明双子叶植物中AS1和单子叶植物中RS2的功能是保守的[37]。

在我们先前的研究中, 小麦TaYAB1在拟南芥中过量表达引起的表型在很大程度上类似于其在拟南芥中的同源基因FIL的过表达表型[28]。

35S::FIL转基因植株的莲座叶的近轴面表皮细胞趋向于远轴面细胞特征[11]。

过量表达 TaYAB1基因也引起转基因莲座叶的近轴面表皮细胞特征部分地趋向野生型
莲座叶的远轴面, 这表明 TaYAB1与 FIL具有相似的功能,都部分地促进了侧生器官的远轴面特征[28]。

本研究中, 在拟南芥中过量表达TaYAB2基因促进了转基因拟
南芥莲座叶片近轴面特征趋向远轴面(图5)。

YAB2和YAB5基因是拟南芥中与TaYAB2同源性较高的基因, 系统进化树分析也表明它们关系较近(图3)。

尽管它们的单突变体 yab2-1和 yab5-1以及双突变体yab2-1 yab5-1的叶片特征与野生
型相似, 没有明显的极性变化[42], 然而四突变体 fil-8 yab2-1 yab3-2 yab5-1 (yab1235)叶片的极性发生了严重缺陷, 显著加强了fil-8 yab3-2的表型[22], 表明YAB2和YAB5两个基因也参与了叶片近-远轴极性的建立。

这些结果均支持小麦TaYAB2基因与拟南芥中YABBY基因相似的功能, 参与叶片近-远轴极性建成的调控。

图6 35S::TaYAB2转基因拟南芥莲座叶表面的扫描电镜观察及叶片组织学分析Fig.
6 Scanning electron microscopic and historical analysis of rosette leaves of 35S::TaYAB2 transgenic Arabidopsis plants(a)野生型拟南芥莲座叶近轴面
(×100)。

(b)野生型拟南芥莲座叶近轴面(×400), 红色箭头指示气孔。

(c)野生型拟
南芥莲座叶远轴面(×100)。

(d)野生型拟南芥莲座叶远轴面(×400)。

(e)转基因植株莲座叶近轴面(×100)。

(f)转基因植株莲座叶近轴面(×400), 红色箭头指示气孔。

(g)转基因植株莲座叶远轴面(×100)。

(h)转基因植株莲座叶远轴面(×400)。

(i)野生拟南芥莲座叶横切面。

(j)转基因植株莲座叶横切面。

(k)为i图中方框内的结构放大图。

(l)为j图方框内的结构放大图。

(m)12 d龄野生型苗端纵切面。

(n)12 d龄转基因植株苗端纵切面。

AD: 近轴面; AB: 远轴面: PA: 栅栏组织; SP: 海绵组织; LP: 叶片原基; SAM: 苗端分生组织。

(i)～(n)的bar = 50 μm。

(a)Adaxial surface of a wild-type rosette leaf (100×). (b)Adaxial surface of a wild-type rosette leaf (400×). (c)Abaxial surface of a wild-type rosette leaf (100×). (d)Abaxial surface of a wild-type rosette leaf (400×). (e)Adaxial surface of a transgenic rosette leaf(100×). (f)Adaxial surface of a transgenic rosette leaf (400×). (g)Abaxial surface of a t ransgenic rosette leaf (100×). (h)Abaxial surface of a transgenic rosette leaf (400×). Stomata in (b)and (d)are indicated by red arrowheads. (i)A transverse section of a wild-type rosette leaf. (j)A transverse section of a transgenic rosette leaf. (k)High magnification of box in (i). (l)High magnification of box in (j). (m)A longitudinal section of wild-type shoot apex in a 12-day-old seedling. (n)A longitudinal section of transgenic shoot apex in a 12-day-old seedling. AD: adaxial surface;
AB:abaxial surface; PA: palisade mesophyll; SP: spongy mesophyll; LP:leaf primodium; SAM: shoot apical meristem. Bar = 50 μm in (i)–(n).
图7 野生型和35S::TaYAB2转基因拟南芥中12日龄叶片近-远轴极性相关基因的表达分析Fig. 7 Analysis of adaxial-abaxial polarity related gene expression in 12-day-old shoots of wild-type and 35S::TaYAB2 transgenic seedlingsTUB: 内参基因AtTUB (At1G04820)。

TUB: internal reference AtTUB (At1G04820)from Arabidopsis thaliana.
图8 野生型拟南芥和35S::TaYAB2转基因拟南芥开花时间的比较Fig. 8 Comparison of flowering-time between wild type plants and 35S::TaYAB2 transgenic plants每一组数据为50株植株的平均值±标准误, 处理间有极显著差
异(P<0.01)。

WT: 野生型; TL: 转基因植株。

(a)野生型对照与35S::TaYAB2转基因植株从播种到抽薹所需天数的比较。

(b)转基因植株与野生型对照开花时莲座叶数目的比较。

Data are indicated as mean ± SE of 50 plants. There was significant difference between WT and TL plants (P<0.01). WT: wild type; TL:transgenic lines. (a)Comparison of days from sowing to bolting between wild type plants and 35S:TaYAB2 transgenic plants. (b)Comparison of rosette leaves number at flowering between wild type plants and
35S:TaYAB2 transgenic plants.
叶片形态建成过程中, 叶原基极性的建立是在一系列基因的精确调控下严格按程序完成的[1]。

拟南芥中, YABBY家族是叶片发育遗传调控途径中下游的一类转录因子, 其基因都在叶远轴面表达[11]。

其中, FIL/YAB1和 YAB3促进叶片远轴面特征建成,其双突变体(fil yab3)的叶很狭窄、远轴面的表皮细胞会有近轴面特征的表皮细胞镶嵌, FIL/YAB1和YAB3的过量表达植株会产生远轴面化的叶片[11]。

在
35S::TaYAB2转基因植株中FIL/YAB1和YAB3基因的表达水平都得到了提高, 说明TaYAB2能够促进这2个基因的表达。

KAN家族是植物特有的一个转录因子家族, KAN基因在叶原基远轴面表达, 其作用是促进叶片远轴面特征的建成。

在叶原基中组成性表达 KAN1或KAN2会产生远轴面化的子叶和辐射对称的棒状叶[12-13,32], 35S::TaYAB2转基因植株中KAN1基因的表达水平高于野生型对照。

由于YABBY基因在叶原基的表达晚于 KAN基因, 处于其下游[43],所以这可能是TaYAB2对KAN基因有反馈调节作用。

此外, 决定叶片近轴面特征的基因 AS1的表达变化不明显。

因此, 35S::TaYAB2转基因植株叶片近轴面特征趋向远轴面可能是由于促进了远轴面特征决定基因的表达造成的。

YABBY基因曾被认为主要功能是调控植物器官极性建成, 而对开花时间没有调节作用。

但是本研究发现, TaYAB2基因除影响叶片近-远轴极性外, 其过量表达还延迟
转基因拟南芥的抽薹时间(图8)。

苗端分生组织是植物花序分生组织形成的细胞基础,它的发育状态能够影响植物花发育进程。

拟南芥细胞分裂素受体突变体ahk2 ahk3 ahk4的苗端分生组织变小, 开花时间延迟[44-46]。

组织切片结果显
示,35S::TaYAB2转基因植株的苗端分生组织比较扁平。

因此, 转基因植株抽薹时间的延迟可能是由于苗端分生组织生长异常造成的。

作为一类植物所特有的基因家族, YABBY基因是在植物长期进化过程中产生的, 在动物基因组中未发现YABBY类似基因。

基因的序列和功能分析表明 TaYAB2是YABBY基因家族成员, 进一步证明在双子叶植物与单子叶植物的进化过程中, YABBY家族成员的基本功能仍然具有很大的保守性。

当然,在长期的植物进化过程中, 拟南芥与玉米、小麦的叶片形态和结构出现明显的区别, 该区别是基因表达调控途径进化而来的。

在双子叶植物拟南芥中,YABBY基因在叶片远轴面表达, yab 多突变体能够引起器官远轴面特征的形成[43], 然而, 单子叶植物玉米中的YABBY 基因却在近轴面中表达[23], 水稻中的YABBY基因表达则不呈现极性分布[24], 这表明在不同物种间极性决定的功能是不完全保守的。

总之, 极性建立是一个复杂的发育过程, 对其分子机制的进一步了解仍需鉴定一些影响极性建立的新的突变体及其基因。

本研究结果有助于进一步理解叶片极性建立的机制。

4 结论
小麦 TaYAB2编码一个 YABBY基因家族成员,其蛋白N端含有典型的C2C2锌指结构域, C端含有YABBY结构域。

该基因在小麦苗端、幼叶、侧芽、幼穗等组织器官中广泛表达。

在拟南芥中过量表达TaYAB2改变了叶片的极性发育, 这为进一步探讨TaYAB2及其类似基因在小麦叶片发育中的功能提供了有益的线索。

References
[1]Cui X-F(崔晓峰), Huang H(黄海). Recent progress in genetic control of。