酵母展示技术及全细胞催化在有机合成的应用
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式和重组质粒构建如图３所示。
将构建ｐＫＦＳ一删Ｌ及ｐＫＮＳ—ＣＡＬＢ质粒分别转化毕氏酵母在三Ｔ酸甘油酯乳化平 扳上筛选，得到Ｇｓｌｌ５／ＦＳＲＭＬ和ＧＳｌｌ５／ＮＳＣＡＬＢ两株重组菌。
瞳２絮糖ｔ酵母展示ＲＭＬ髓肪舅囊体鞫毫
圈３＂强素蠢酵母晨示ＣＡＬＢ腊胁一曩＊拇硅
２基于酵母展示技术的全细胞脂肪酶催化剂制各 重组毕氏酵母外源蛋白表达菌株可高密度发酵培养，营养要求低，利于工业 化放大生产，而且自身分泌的蛋白质非常少，有利于高效表达外源蛋白。外源基因 通过整合型质粒进入毕赤酵母染色体基因组，结构稳定，不易丢失，外源蛋白质
１０
醇＋ＤＭＳＯ，丙酮＋ＤＭＳ０，正己烷＋ＤＭＳ０）中全细胞脂肪酶催化反应合成糖酯，同时以 商品脂肪酶Ｎｏｖ０４３５及全细胞脂肪酶ＲＭＬ催化剂的催化合成进行比较。反应条件： ０．３９脂肪酶，０．５９５９葡萄糖（３ｍｍ０１），月硅酸１．２９（６ｍｍ０１），１．Ｏｇ分子筛，５ｍｌ反 应体系，５５。Ｃ，７２ｈ。复合溶剂４：ｌ（ｖ／ｖ）。初步得到全细胞脂肪酶ＣＡＬＢ催化剂催 化合成月桂酸单糖酯的效率超过对应商品酶的５０％。 结束语 综上所述，利用基于酵母展示体系的全细胞催化技术无需酶的提取纯化，减少 了酶活性在制备过程中的损失，节省了生产中的设备投资和运行费用。同时酵母 展示脂肪酶体现了固定化酶的优势，与游离酶相比，易于回收，可反复使用。进
利用酵母展示ＣＡＬＢ全细胞脂肪酶在设反应条件为：０．９６５９大豆油设定芳香酯
合成反应条件为：在反应体系中加入一定量的正庚烷，分别加入底物酸（０．４ｍｏｌ／Ｌ）
和Ｎｏｖ０４３５或ＣＡＬＢ—ｌ冻干粉／ＣＡＬＢ－２冻干粉（０．１９），酸：醇＝ｌ：１．５（ｍｏｌ比）的
比例加入底物醇，加入分子筛除水，在５５℃下酶催化合成反应，并定时监控转化
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｏｎ
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ西ｉａｅ ｂｙ ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｅ ａｎｄ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ
ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００１，５５：４７１＿４７５
母表面展示ＲＭＬ脂肪酶催化合成反应７２ｈ后，反应的脂肪酸甲酯产率达到８１．３３％。
以上反应７２ｈ结束后，将全细胞脂肪酶催化剂用丙酮清洗酶粉，然后放予室 温晾干。接着加入到含有新鲜反应底物的如上反应液中，开始下一批次的反应。 全细胞脂肪酶ＲＭＬ能有效催化脂肪酸甲酯的合成，重复利用８批次后，脂肪酸甲 酯产率与第一批相比，仍能达到其８１．２８％，工作时间达５７６ｈ。 ４全细胞脂肪酶催化剂在芳香酯生物合成中的应用
８
ｌ毕氏酵母展示体系的构建 通过ＰｃＲ扩增获得酿酒酵母絮凝素Ｆｌｏｌ基因Ｆｓ片段，以米赫撮毛霉基因组 为模板扩增获得约］ｋｂ的含前肚的脂肪酶基困片段Ｐｒｏ础ＭＬ。利用限制性内切酵将 上述片段双切以后，依次连接到质粒ｐＰＩＣｇＫ中，构建获得展示表达质粒ｐＫＦＳ—ＲＭＬ， 蛋白融合方式和重组质粒构建如图２所示。 此外，通过ＰＣＲ扩增获得酿酒酵母 凝聚素基因片段，以古南极假丝酵母 基因组为模板扩增获得约Ｉｋｂ的脂肪酶基因片段ＣＡＬＢ。利用限制性内切酶将上述 片段双切以后，依次连接到质粒ｐＰＩＣ９Ｋ中，构建获得展示表达质粒．蛋白融合方
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００７．７５：１３１９一１３２５
【７】Ｔ
Ｔａｎｉｎｏ，Ｔ
Ａｏｋｉ，Ｗ Ｃｈｕｎｇ，ｅｌ ａ１．，Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ
ｏｆ ａ Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ ｌｉｐａｓｅ
Ｂ・－ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｙｅａｓｔ ｗｈｏｌｅ－・ｃｅｌｌ ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｐｏｌｙｅｓｔｅｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ａｐｐｌ
【２】Ｓ Ｓｈｉｒａｇａ，Ｍ Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｍ
ｌｉｐａｓｅ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ
ｏｎ
Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，ｅｔ ａｌ，Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ
ａ
ｙｅａｓｔ ｅｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅｓ ｉｎ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔｓ：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｓ
ｗｈｏｌｅ—ｃｅｌｌ
表达量较高。
将重组外潭脂肪酶的菌株ＧＳＩｌＳ／ＦＳＲＭＬ和ＧＳＩ １５／ＮＳＣＡＬＢ分别接种于ＹＰＤ培养 基中，２００ｒｐｍ，３０℃培养２４ｈ：然后转入发酵罐（工作体积为３０Ｌ）在ＢＳＭ培养基 中进行批式发酵。约２４ｈ后甘油耗尽，开始流加ＢＳ），ｔ和甲醇发酵产酶．获得高教 全细胞脂肪酶。 发酵完毕，离心收集茁体。并用添加吉有一定量保护荆的缓冲液清洗ｔ再经 真空冷冻干燥冻干制备脂肪酶全细胞催化荆。 ３全细胞脂肪酶催化剂在脂肪酸甲酯生物合成中的应用 脂肪酸甲酯（ＦＡＭＥ）是由动、植物油脂在酸、碱、酶催化下经甲醇醇解制备 的．原来几乎全部用作合成其他化学品的中间体。近来由于各国为防止大气污染． 制定了严格的汽车尾气排放标准，因此都在大力发展清洁燃料。ＦＡＭＥ作为一种清 洁的可再生能源受到了普遍的关注，人们也称之为生物柴油。
乙酯、乙酸异戊酯及己酸乙酯（数据未显示）等短链芳香酯合成中显示了明显的 优势。
５全细胞脂肪酶催化剂在糖酯生物合成中的应用 糖酯作为一种非离子型表面活性剂，能降低水的表面张力形成胶束，具有乳
化、渗透、粘度调节和防止晶析等多种功能，已广泛应用于医药、食品及化妆品 等工业。目前，工业生产糖酯主要采用化学合成法，用化学法合成选择性差，产 率低，且需在高温高压条件下进行，糖环会发生聚合，且不易进行特定位置的酯 化，其副产品的变性和致癌性引起人们越来越多的关注。１９８６年Ｋ１ｉｂａｎｏｖ等首创 以吡啶为溶剂用猪胰脂肪酶催化糖酯合成，得到了６－０－酰基一葡萄糖酯，此后酶法
率。
研究结果表明：凝集素毕氏酵母脂肪酶展示ＣＡＬＢ－２相对絮凝素毕氏酵母脂肪 酶展示ＣＡＬＢ一１在合成反应中效率有不同程度的提高。对丙酸乙酯合成而言，达到
最大转化率的时间从原９小时缩短为６小时；对于乙酸异戊酯来说，虽然ＣＡＬＢ－２
的优势没有特别明显，但其转化率始终优于ＣＡＬＢ－Ｉ：对于己酸乙酯合成而言， ＣＡＬＢ－Ｉ需要６小时左右才能达到转化率９０％以上，而ＣＡＬＢ一２只需要２小时就达到 转化率９０％的水平。相对诺维信商品脂肪酶Ｎｏｖ０４３５，全细胞脂肪酶催化剂在丙酸
９
利用酵母展示ＲＭＬ全细胞脂肪酶在设反应条件为：０．９６５９大豆油，分别在Ｏｈ， ２４ｈ和４８ｈ加入甲醇，醇油摩尔比为１．５：ｌ，反应体系异辛烷／油（ｖ／ｖ）２：１，温 度５５℃，摇床转速２００ｒｐｍ，反应时间７２ｈ，酶量（ｐＫＦＳ—ＲＭＬ）为０．３６９，其中全细
胞脂肪酶酶粉，大豆油，甲醇和异辛烷均在硝酸钠饱和盐溶液中平衡８Leabharlann Baiduｈ。毕赤酵
【４】Ｔ
Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｈ Ｆｕｋｕｄａ，Ｍ Ｕｅｄａ，ｅｌ ａ１．，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｙｅａｓｔ
ｏｎ
ｓｔｒａｉｎｓ州ｔｈ ｈｉｇｌｌ ｅｅｌｌ
ｔｈｅ Ｆｌｏ ｌ ｐ
ｓｕｒｆａｃｅ ｌｉｐａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｎｏｖｅｌ ｄｉｓｐｌａｙ ｓｙｓｔｅｍｓ ｂａｓｅｄ ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｏｍａｉｎ，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ
ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ ｉｎ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔｓ，Ａｐｐ，Ｅｎｖｉｒ
Ｍｉｃｒｏｂ，２００５，７ ｌ：４３３５．４３３８ ａｌ，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ
ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｅ ｅｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ
【３】Ｓ Ｓｈｉｂａｓａｋｉ，Ｍ
ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ
Ｕｅｄａ，Ｔ Ｉｉｚｕｋａ，Ｈｉｒａｙａｍａ Ｍ，ｅｌ
【５】Ｔ Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｍ
６４：４８ｌ＿４８５
Ｉｔｏ，Ｈ Ｆｕｋｕｄａ，ｅｔ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００２，６８：４５ ｌ ７＿４５２２ ａ１．，Ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ
ｌｉｐａｓｅ—ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｙｅａｓｔ，ｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌ ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ，Ａｐｐｌ
酵母展示技术及全细胞催化在有机合成的应用
林影黄登峰任昌琼李华珍金干 华南理工走学生抽科擘与工程学院，广州番禺走学城５１０００６
酵母展示技术是将外源蛋白与酵母细胞壁蛋白的融台，升将外源蛋白表达在 酵母细胞表面。酵母展示技术已广泛应用于各种功能蛋白的表选及筛选。本文重 点介绍酵母展示技术在脂肪酶展示体系构建及其在脂肪酸ｌｆｌ酯、短链芳香酯及糖 酯生物合成的应用。 ＢＩ言 大量的研究表明酵母展示技术具有多种功能在生物技术中广泛应用。如：抗 体酶筛选、抗原特异性改造、吸附细胞构建及全细胞催化剂制备［卜４］。将酶分子 在酵母细胞表面隧示可以实现直接酶的固定化，减少酶分离纯化的复杂工艺．提 高酶的回收率，降低制各成本等，具有重要的应用价值。 酵母展示技术主要利用酵母细胞壁蛋白，如：酵母凝集桑、酵母絮凝素等， 与外源蛋白的融合，融合蛋白表达分泌途中由于细胞壁糖基化蛋白与细胞壁的结 合作用，将外源蛋白锚定在细胞壁上．如图ｌ所示。 腊肪酶（Ｌｉｐａｓｅ．Ｅｃ ３ ｌ １．３）是一类重 要的酯健水解酶，能催化天然的底物油脂水解． 与其他水解酶类相似，脂肪酶催化的水解反应 也具有可逆性．可催化酯类化合物的分解、合 成和酯交换，具有化学选择性和高度的立体异 构专一性．反应条件温和．目Ⅱ产物少。已有报 道将脂肪酶在酵母细胞展示，具有固定化酶的 稳定性高、耐性强、易回收利用等优良特性， 作为全细胞催化剂应用于生物催化反应，尤其 在生物转化与合成中特显优势【５—７】。此外，由 于其具有可再生及细胞表面在线检测分析的特 性，已被应用于酶分子定向进化与催化偶聪的 高通量筛选技术体系的构建。
催化合成糖酯的研究在国内外各相关实验室相继展开，发现利用商品的南极假丝
酵母脂肪酶Ｎｏｖｏｚｙｍ４３５在糖的伯羟基位置上具有良好的反应区域选择性，催化酯
化合成高纯度的６一ｏ－酰基一糖酯。 本研究以全细胞脂肪酶ＣＡＬＢ为催化剂，以葡萄糖和月桂酸为底物：在几种单 一有机溶剂（叔丁醇，叔戊醇，丙酮，正己烷）和复合有机溶（叔丁醇＋ＤＭＳＯ，叔戊
崮ｌ ｄ凝聚桑融台蚩一转廷示意图
来源于南极假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａ目ｎｔａＰｃｔｉｃａ）的脂肪酶分为Ａ（ＣＡＬＡ）与Ｂ（ｃＡＬＢ） 两种类型，其中ＣＡＬＢ的晶体结构已经测定。ＣＡＬＢ韵用途最为广泛，近几年的研究 成果表明，ＣＡＬＢ在酯化、水解、转酯、以及其它类型反应中都显示了鞍其它脂肪 酶更为出色的催化性能［８］。此外，米黑根毛霉脂肪酶（肋ＩｚｏｍｕｃｏＹｍｉｅｈｅｉ¨ｐａｓｅ． Ｒ札）是一条ｏ／０型单链多肽，有着明显的界面激话效应，固定化的Ｒ虬可在非 水相反应体系中高效催化酯交换、酯合成，因而其固定化技术得到广泛研究［９． １０］。本文重点研究基于酵母展示技术脂肪酶（ＣＡＬＢ与ＲＭＩ）全细胞催化剂的制备． 及其在脂肪酸甲酯、短链芳香酯及槠酯生物台成的应用。
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００４，
Ｃａｎｄｉｄａ
【６】Ｔ Ｔａｎｉｎｏ，Ｔ Ｏｈｎｏ，Ｔ
Ａｏｋｉ，ｅｔ ａＬ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｃｅｌｌｓ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ
ａｎｔａｒｃｔｉｃａ ｌｉｐａｓｅ Ｂ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｅｓｔｅｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
利用酶法生产香味物质，已有相关专利报道。如用脂肪酶催化己酸与乙醇反应， 产生的己酸乙酯用于勾兑白酒、调配香精，在香味的协调性，使用的安全性上都优
于化学合成的己酸乙酯。酯类是水果中的主要香味化合物。用脂肪酶可以催化酯 化反应、酯基转移反应和内酯化反应，可以进行风味酯的合成。目前，已有５０多种 的酯可以由酶法合成。
一步提高酶的制备效率及酶的催化活性，将有利于工业化大规模生产的推广。 参考文献
【１］Ｓ Ａ Ｇａｉ，Ｋ
Ｄ
Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｙｅａｓｔ
ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，Ｃｕｒ Ｏｐｉｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ，２００７，１ ７：４６７．４７３
将构建ｐＫＦＳ一删Ｌ及ｐＫＮＳ—ＣＡＬＢ质粒分别转化毕氏酵母在三Ｔ酸甘油酯乳化平 扳上筛选，得到Ｇｓｌｌ５／ＦＳＲＭＬ和ＧＳｌｌ５／ＮＳＣＡＬＢ两株重组菌。
瞳２絮糖ｔ酵母展示ＲＭＬ髓肪舅囊体鞫毫
圈３＂强素蠢酵母晨示ＣＡＬＢ腊胁一曩＊拇硅
２基于酵母展示技术的全细胞脂肪酶催化剂制各 重组毕氏酵母外源蛋白表达菌株可高密度发酵培养，营养要求低，利于工业 化放大生产，而且自身分泌的蛋白质非常少，有利于高效表达外源蛋白。外源基因 通过整合型质粒进入毕赤酵母染色体基因组，结构稳定，不易丢失，外源蛋白质
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醇＋ＤＭＳＯ，丙酮＋ＤＭＳ０，正己烷＋ＤＭＳ０）中全细胞脂肪酶催化反应合成糖酯，同时以 商品脂肪酶Ｎｏｖ０４３５及全细胞脂肪酶ＲＭＬ催化剂的催化合成进行比较。反应条件： ０．３９脂肪酶，０．５９５９葡萄糖（３ｍｍ０１），月硅酸１．２９（６ｍｍ０１），１．Ｏｇ分子筛，５ｍｌ反 应体系，５５。Ｃ，７２ｈ。复合溶剂４：ｌ（ｖ／ｖ）。初步得到全细胞脂肪酶ＣＡＬＢ催化剂催 化合成月桂酸单糖酯的效率超过对应商品酶的５０％。 结束语 综上所述，利用基于酵母展示体系的全细胞催化技术无需酶的提取纯化，减少 了酶活性在制备过程中的损失，节省了生产中的设备投资和运行费用。同时酵母 展示脂肪酶体现了固定化酶的优势，与游离酶相比，易于回收，可反复使用。进
利用酵母展示ＣＡＬＢ全细胞脂肪酶在设反应条件为：０．９６５９大豆油设定芳香酯
合成反应条件为：在反应体系中加入一定量的正庚烷，分别加入底物酸（０．４ｍｏｌ／Ｌ）
和Ｎｏｖ０４３５或ＣＡＬＢ—ｌ冻干粉／ＣＡＬＢ－２冻干粉（０．１９），酸：醇＝ｌ：１．５（ｍｏｌ比）的
比例加入底物醇，加入分子筛除水，在５５℃下酶催化合成反应，并定时监控转化
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｏｎ
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ西ｉａｅ ｂｙ ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｅ ａｎｄ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ
ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００１，５５：４７１＿４７５
母表面展示ＲＭＬ脂肪酶催化合成反应７２ｈ后，反应的脂肪酸甲酯产率达到８１．３３％。
以上反应７２ｈ结束后，将全细胞脂肪酶催化剂用丙酮清洗酶粉，然后放予室 温晾干。接着加入到含有新鲜反应底物的如上反应液中，开始下一批次的反应。 全细胞脂肪酶ＲＭＬ能有效催化脂肪酸甲酯的合成，重复利用８批次后，脂肪酸甲 酯产率与第一批相比，仍能达到其８１．２８％，工作时间达５７６ｈ。 ４全细胞脂肪酶催化剂在芳香酯生物合成中的应用
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ｌ毕氏酵母展示体系的构建 通过ＰｃＲ扩增获得酿酒酵母絮凝素Ｆｌｏｌ基因Ｆｓ片段，以米赫撮毛霉基因组 为模板扩增获得约］ｋｂ的含前肚的脂肪酶基困片段Ｐｒｏ础ＭＬ。利用限制性内切酵将 上述片段双切以后，依次连接到质粒ｐＰＩＣｇＫ中，构建获得展示表达质粒ｐＫＦＳ—ＲＭＬ， 蛋白融合方式和重组质粒构建如图２所示。 此外，通过ＰＣＲ扩增获得酿酒酵母 凝聚素基因片段，以古南极假丝酵母 基因组为模板扩增获得约Ｉｋｂ的脂肪酶基因片段ＣＡＬＢ。利用限制性内切酶将上述 片段双切以后，依次连接到质粒ｐＰＩＣ９Ｋ中，构建获得展示表达质粒．蛋白融合方
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００７．７５：１３１９一１３２５
【７】Ｔ
Ｔａｎｉｎｏ，Ｔ
Ａｏｋｉ，Ｗ Ｃｈｕｎｇ，ｅｌ ａ１．，Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ
ｏｆ ａ Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ ｌｉｐａｓｅ
Ｂ・－ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｙｅａｓｔ ｗｈｏｌｅ－・ｃｅｌｌ ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｐｏｌｙｅｓｔｅｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ａｐｐｌ
【２】Ｓ Ｓｈｉｒａｇａ，Ｍ Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｍ
ｌｉｐａｓｅ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ
ｏｎ
Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，ｅｔ ａｌ，Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ
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表达量较高。
将重组外潭脂肪酶的菌株ＧＳＩｌＳ／ＦＳＲＭＬ和ＧＳＩ １５／ＮＳＣＡＬＢ分别接种于ＹＰＤ培养 基中，２００ｒｐｍ，３０℃培养２４ｈ：然后转入发酵罐（工作体积为３０Ｌ）在ＢＳＭ培养基 中进行批式发酵。约２４ｈ后甘油耗尽，开始流加ＢＳ），ｔ和甲醇发酵产酶．获得高教 全细胞脂肪酶。 发酵完毕，离心收集茁体。并用添加吉有一定量保护荆的缓冲液清洗ｔ再经 真空冷冻干燥冻干制备脂肪酶全细胞催化荆。 ３全细胞脂肪酶催化剂在脂肪酸甲酯生物合成中的应用 脂肪酸甲酯（ＦＡＭＥ）是由动、植物油脂在酸、碱、酶催化下经甲醇醇解制备 的．原来几乎全部用作合成其他化学品的中间体。近来由于各国为防止大气污染． 制定了严格的汽车尾气排放标准，因此都在大力发展清洁燃料。ＦＡＭＥ作为一种清 洁的可再生能源受到了普遍的关注，人们也称之为生物柴油。
乙酯、乙酸异戊酯及己酸乙酯（数据未显示）等短链芳香酯合成中显示了明显的 优势。
５全细胞脂肪酶催化剂在糖酯生物合成中的应用 糖酯作为一种非离子型表面活性剂，能降低水的表面张力形成胶束，具有乳
化、渗透、粘度调节和防止晶析等多种功能，已广泛应用于医药、食品及化妆品 等工业。目前，工业生产糖酯主要采用化学合成法，用化学法合成选择性差，产 率低，且需在高温高压条件下进行，糖环会发生聚合，且不易进行特定位置的酯 化，其副产品的变性和致癌性引起人们越来越多的关注。１９８６年Ｋ１ｉｂａｎｏｖ等首创 以吡啶为溶剂用猪胰脂肪酶催化糖酯合成，得到了６－０－酰基一葡萄糖酯，此后酶法
率。
研究结果表明：凝集素毕氏酵母脂肪酶展示ＣＡＬＢ－２相对絮凝素毕氏酵母脂肪 酶展示ＣＡＬＢ一１在合成反应中效率有不同程度的提高。对丙酸乙酯合成而言，达到
最大转化率的时间从原９小时缩短为６小时；对于乙酸异戊酯来说，虽然ＣＡＬＢ－２
的优势没有特别明显，但其转化率始终优于ＣＡＬＢ－Ｉ：对于己酸乙酯合成而言， ＣＡＬＢ－Ｉ需要６小时左右才能达到转化率９０％以上，而ＣＡＬＢ一２只需要２小时就达到 转化率９０％的水平。相对诺维信商品脂肪酶Ｎｏｖ０４３５，全细胞脂肪酶催化剂在丙酸
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利用酵母展示ＲＭＬ全细胞脂肪酶在设反应条件为：０．９６５９大豆油，分别在Ｏｈ， ２４ｈ和４８ｈ加入甲醇，醇油摩尔比为１．５：ｌ，反应体系异辛烷／油（ｖ／ｖ）２：１，温 度５５℃，摇床转速２００ｒｐｍ，反应时间７２ｈ，酶量（ｐＫＦＳ—ＲＭＬ）为０．３６９，其中全细
胞脂肪酶酶粉，大豆油，甲醇和异辛烷均在硝酸钠饱和盐溶液中平衡８Leabharlann Baiduｈ。毕赤酵
【４】Ｔ
Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｈ Ｆｕｋｕｄａ，Ｍ Ｕｅｄａ，ｅｌ ａ１．，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｙｅａｓｔ
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ｓｔｒａｉｎｓ州ｔｈ ｈｉｇｌｌ ｅｅｌｌ
ｔｈｅ Ｆｌｏ ｌ ｐ
ｓｕｒｆａｃｅ ｌｉｐａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｎｏｖｅｌ ｄｉｓｐｌａｙ ｓｙｓｔｅｍｓ ｂａｓｅｄ ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｏｍａｉｎ，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ
ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ ｉｎ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔｓ，Ａｐｐ，Ｅｎｖｉｒ
Ｍｉｃｒｏｂ，２００５，７ ｌ：４３３５．４３３８ ａｌ，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ
ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｅ ｅｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ
【３】Ｓ Ｓｈｉｂａｓａｋｉ，Ｍ
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ｌｉｐａｓｅ—ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｙｅａｓｔ，ｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌ ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ，Ａｐｐｌ
酵母展示技术及全细胞催化在有机合成的应用
林影黄登峰任昌琼李华珍金干 华南理工走学生抽科擘与工程学院，广州番禺走学城５１０００６
酵母展示技术是将外源蛋白与酵母细胞壁蛋白的融台，升将外源蛋白表达在 酵母细胞表面。酵母展示技术已广泛应用于各种功能蛋白的表选及筛选。本文重 点介绍酵母展示技术在脂肪酶展示体系构建及其在脂肪酸ｌｆｌ酯、短链芳香酯及糖 酯生物合成的应用。 ＢＩ言 大量的研究表明酵母展示技术具有多种功能在生物技术中广泛应用。如：抗 体酶筛选、抗原特异性改造、吸附细胞构建及全细胞催化剂制备［卜４］。将酶分子 在酵母细胞表面隧示可以实现直接酶的固定化，减少酶分离纯化的复杂工艺．提 高酶的回收率，降低制各成本等，具有重要的应用价值。 酵母展示技术主要利用酵母细胞壁蛋白，如：酵母凝集桑、酵母絮凝素等， 与外源蛋白的融合，融合蛋白表达分泌途中由于细胞壁糖基化蛋白与细胞壁的结 合作用，将外源蛋白锚定在细胞壁上．如图ｌ所示。 腊肪酶（Ｌｉｐａｓｅ．Ｅｃ ３ ｌ １．３）是一类重 要的酯健水解酶，能催化天然的底物油脂水解． 与其他水解酶类相似，脂肪酶催化的水解反应 也具有可逆性．可催化酯类化合物的分解、合 成和酯交换，具有化学选择性和高度的立体异 构专一性．反应条件温和．目Ⅱ产物少。已有报 道将脂肪酶在酵母细胞展示，具有固定化酶的 稳定性高、耐性强、易回收利用等优良特性， 作为全细胞催化剂应用于生物催化反应，尤其 在生物转化与合成中特显优势【５—７】。此外，由 于其具有可再生及细胞表面在线检测分析的特 性，已被应用于酶分子定向进化与催化偶聪的 高通量筛选技术体系的构建。
催化合成糖酯的研究在国内外各相关实验室相继展开，发现利用商品的南极假丝
酵母脂肪酶Ｎｏｖｏｚｙｍ４３５在糖的伯羟基位置上具有良好的反应区域选择性，催化酯
化合成高纯度的６一ｏ－酰基一糖酯。 本研究以全细胞脂肪酶ＣＡＬＢ为催化剂，以葡萄糖和月桂酸为底物：在几种单 一有机溶剂（叔丁醇，叔戊醇，丙酮，正己烷）和复合有机溶（叔丁醇＋ＤＭＳＯ，叔戊
崮ｌ ｄ凝聚桑融台蚩一转廷示意图
来源于南极假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａ目ｎｔａＰｃｔｉｃａ）的脂肪酶分为Ａ（ＣＡＬＡ）与Ｂ（ｃＡＬＢ） 两种类型，其中ＣＡＬＢ的晶体结构已经测定。ＣＡＬＢ韵用途最为广泛，近几年的研究 成果表明，ＣＡＬＢ在酯化、水解、转酯、以及其它类型反应中都显示了鞍其它脂肪 酶更为出色的催化性能［８］。此外，米黑根毛霉脂肪酶（肋ＩｚｏｍｕｃｏＹｍｉｅｈｅｉ¨ｐａｓｅ． Ｒ札）是一条ｏ／０型单链多肽，有着明显的界面激话效应，固定化的Ｒ虬可在非 水相反应体系中高效催化酯交换、酯合成，因而其固定化技术得到广泛研究［９． １０］。本文重点研究基于酵母展示技术脂肪酶（ＣＡＬＢ与ＲＭＩ）全细胞催化剂的制备． 及其在脂肪酸甲酯、短链芳香酯及槠酯生物台成的应用。
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００４，
Ｃａｎｄｉｄａ
【６】Ｔ Ｔａｎｉｎｏ，Ｔ Ｏｈｎｏ，Ｔ
Ａｏｋｉ，ｅｔ ａＬ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｃｅｌｌｓ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ
ａｎｔａｒｃｔｉｃａ ｌｉｐａｓｅ Ｂ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｅｓｔｅｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
利用酶法生产香味物质，已有相关专利报道。如用脂肪酶催化己酸与乙醇反应， 产生的己酸乙酯用于勾兑白酒、调配香精，在香味的协调性，使用的安全性上都优
于化学合成的己酸乙酯。酯类是水果中的主要香味化合物。用脂肪酶可以催化酯 化反应、酯基转移反应和内酯化反应，可以进行风味酯的合成。目前，已有５０多种 的酯可以由酶法合成。
一步提高酶的制备效率及酶的催化活性，将有利于工业化大规模生产的推广。 参考文献
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ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，Ｃｕｒ Ｏｐｉｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ，２００７，１ ７：４６７．４７３