成年SD大鼠心肌细胞分离及其胞内钙离子动态变化测定

成年SD大鼠心肌细胞分离及其胞内钙

离子动态变化测定

（作者： _________ 单位： ___________ 邮编：___________ ）

【摘要】目的：建立稳定的成年SD大鼠心肌单细胞分离方法，并对心肌细胞内Ca2+动态变化进行测定。方法：用改进的Langendoff装置，行大鼠主动脉插管逆向灌流（温度、pH、水质恒定），用混合液（0.6mg/mL胶原酶H+0.06mg/mL蛋白酶+1mg/mL牛血清白蛋白）消化心脏，经3次不同浓度含钙台式液复钙后得到钙稳态心肌细胞；室温静置1〜2h后于激光共聚焦显微镜下测定Ca2+的动态变化。结果：得到70%〜90%长杆状活细胞，钙稳态心肌细胞可占40%〜60% ; fluo_4 AM负载染色后可记录到典型的诱发钙瞬变。结论：胶原酶和蛋白酶混合液主动脉逆向灌流方法可以得到具有正常生理功能的钙稳态心肌细胞，可用于心肌细胞内钙信号研究。

【关键词】大鼠心肌细胞细胞分离激光共聚焦显微镜

Cardiomyocyte Isolation from Adult SD Rat Heart for Con focal Microscopic In tracellular Ca2+ Imagi ng

[Abstract ] Objective: To develop a stable method for adult

SD rat sin gle cardiomyocyte isolati on , and the n to determ ine the

in tracellular Ca2+ sig nalli ng by con focal imagi ng. Methods: Rat heart was digested by aorta retrograde perfusion with mixture

[collagenase 11(0.6 mg/mL), pronase(0.06 mg/mL)and bovine serum albumin(1 mg/mL) ] using a modified Langendorff system. The temperature, pH and water quality should be properly con trolled in the process of digested rat heart. Three times of re_calcificati on with differe nt concen trati on of Ca2+ Tyrode soluti on were used to procure calcium homeostasis ven tricular cardiomyocytes. Sin gle cell was used for con focal microscopic Ca2+ imaging after storage at room temperature for 1~ 2 hours. Results: There were about 70% ~ 90% rod_shaped fresh viable cells, in which 40% ~ 60% were calcium homeostasis cells. In single calcium homeostasis cardiomyocytes calcium transients could be evoked by a stimulator and recorded with an LSM510 con focal microscopic system after in cubati on with fluo_4 AM. Conclusion: Aorta retrograde perfusion with collagenase II and pron ase is a proper method to procure sin gle calcium homeostasis cardiomyocytes from adult SD rat with normal physiological features, and fit for con focal microscopic Ca2+ imagi ng.

[Key Words ] rat; cardiomyocyte; cell isolation; laser scanning con focal microscopy

随着心脏疾病研究的不断发展，具备正常生理功能的单个心肌细胞已成为研究心脏代谢、功能、病理生理机制的重要基础，心肌细胞内钙离子浓度（［Ca2+ ］i）变化是一系列心脏疾病的诱因及病理基

础。激光扫描共聚焦显微镜的应用，可使人们对活细胞的多种功能进行直接的观察和精确的动态分析，其中对心肌细胞内［Ca2+ ］i变化的动态检测即为主要应用之一］1〜3 ］。本文主要探讨心肌单细胞的分离方法并用激光共聚焦显微镜和fluo_4 AM负载方法检测分离所得心肌细胞内Ca2+的动态变化，为心肌细胞内钙信号研究及其系列研究工作奠定基础。

1材料与方法

1.1动物与试剂

实验动物：清洁级成年SD大鼠（广州南方医科大学实验动物中心提供）65只，雌雄不拘，体质量200〜300g。主要试剂：胶原酶H（277u/mg,lnvitrogen 公司，美国），蛋白酶（5.8u/mg）、牛磺酸、牛血清白蛋白（BSA）、HEPES（Sigma 公司，美国），fluo_4 AM（Molecular Probes 公司，美国），其余试剂为国产AR试剂。

1.2溶液组成及配制

1.2.1 台式液（mmol/L，用NaOH 调节pH 7.35 〜7.45） NaCl 136.9，KCl 5.4，CaCl2 1，MgCl2 1，NaH2PO4 1，HEPES 10，Taurine 10，D_glucose 11.1

1.2.2 无钙台式液（mmol/L，用NaOH 调节pH 7.35 〜7.45）