第三章 抗体123-课件

(五)IgE
血清中含量很低，在血清中含量为 0.3ug/ml,是一类亲细胞抗体，可与肥大细 胞、嗜碱性粒细胞上的高亲和力Fc ε受体 FcεRⅠ）（ γ、α、μ、δ、ε ）结合，引起 Ⅰ型超敏反应，Fc εRⅡ分布于巨噬细 胞、B细胞、嗜酸粒细胞。
四、免疫球蛋白的生物学活性
V区的功能: Fab片段的生物学活性 抗体 结合抗原的活性由Fab所呈现，由VH和 VL所组成的抗原结合部位，可结合抗 原，是决定抗体分子特异性的部位。
3、基因工程抗体：利用基因工程技术来 制备的抗体分子称为基因工程抗体，是 分子水平的抗体。
1、多克隆抗体(PcAb)
采用传统的免疫方法，将抗原物质经不同途 径进入动物体内，经免疫后，分离出血清， 由此获得的抗血清即为多克隆抗体。细菌 病毒抗原，均是由多种抗原成分组成，即 使纯蛋白质抗原分子也含有多种抗原表位， 因此进入机体后可激活许多淋巴细胞克隆， 机体可产生针对各种抗原成分或抗原表位 的抗体，由此获得的抗血清是一种多克隆 的混合抗体，具有高度的异质性。 一只 小鼠能产生约107-108 种不同抗体，人约 109种。
同种异型（allotype）：指Ig在同一种动 物不同个体之间呈现出的抗原性。同种 异型的抗原决定簇存在于IgG、IgA、 IgE的重链C区和k型轻链的C区。同种异 型是Ig稳定的遗传标志，可用于亲子鉴 定。
独特型（idiotope）：抗体分子的特异性 是由Ig的重链和轻链可变区所决定的，因 此体内针对不同抗原分子的抗体之间的差 别表现在Ig分子的可变区，这种差别就决 定了抗体分子在机体内具有抗原性，由抗 体分子的可变区呈现的抗原性就称为Ig的 独特型。
機制：體內原先曾接觸過敏原，且已經對過敏原產生特異性抗 體 (IgE)。當再次接觸過敏原時，體內肥大細胞 (mast cells)或 嗜碱性粒細胞 (Basophils)立即釋放組織胺(histamine), leukotrienes等引起過敏症狀的物質。二型過敏反應：細胞毒 性（cytotoxic）機制：体内內原先曾接觸過敏原，且已經對過 敏原產生特異性抗體( IgG或IgM)。具特異性的IgG或IgM抗 體與細胞表面的過敏原結合，藉由活化補體或细胞毒性T細胞， 破壞被過敏原所附著的細胞。三型過敏反應：透過免疫複合 物活化補體 (immune complex) 機制：過敏原與體內的IgG或 IgM形成免疫複合物，堆積在體內，引起补体被活化，造成 组织的破壞。四型過敏反應：遲發型，細胞媒介 (cellmediated) 機制：過敏原引起體內CD4+T細胞被活化，因而釋 出細胞間素（cytokine）導致組織和器官受損，常於暴露過敏 原24-72小時後發生。
IgA的特点
参与皮肤粘膜的局部抗感染作用； 初乳中含有高浓度的sIgA----母乳喂养； 通过替代途径激活补体； 参与Ⅲ型超敏反应。
sIgA的合成 和主要作用 部位在黏膜
(四)IgD
很少分泌，在血清中含量极低，占血清总 Ig的0.2%，在血清中含量为30ug/ml,不稳 定，易降解， IgD是B细胞的重要表面标 志，mIgD的出现标志着B细胞成熟，对防 止免疫耐受有一定作用。
2、 单克隆抗体(McAb)
由一个B细胞分化增殖的子代细胞(浆细胞) 产生的针对单一抗原决定簇的抗体，称为 单克隆抗体。
McAb的特点： McAb的重链、轻链及其V 区独特型的特异性、亲和力、生物学性状 及分子结构均完全相同。
McAb技术原理：用人工的方法将产生特 异性抗体的B细胞与同系骨髓瘤细胞融合， 形成B细胞杂交瘤细胞，这种杂交瘤细胞 既具有骨髓瘤细胞无限繁殖特性，又具有 B细胞分泌特异性抗体的能力，由克隆化 的B细胞杂交瘤所产生的抗体即为单克隆 抗体。
FcR结合(免疫调理,I型超敏 反应)
三、五类免疫球蛋白的特性与功能
（一）IgG IgG多为单体，是唯一能通过胎盘的抗体， 据重链（链）免疫原性，IgG分4个亚型。
IgG的特点
IgG1、IgG2和IgG3能通过经典途径激活补 体；（补体是存在于人或脊椎动物血清与 组织液和细胞膜表面的一组被激活后具有 酶活性的蛋白质,包含30多种成分,被称为补 体系统。）
第三章 抗体123-课件
抗体和免疫球蛋白的关系: 抗体都是 免疫球蛋白，并非所有免疫球蛋白都 具有抗体活性。
分泌型Ig(sIg)和膜型Ig(mIg)。
二、免疫球蛋白的分子结构
（一）免疫球蛋白的基本结构
四肽链结构 ，链间二硫键连接;两条重链 （H）和两条轻链（L）;氨基端和羧基端。
1.重链与轻链
C区的功能：
Fc片段的生物学活性：该片段无结合抗原 活性，但与抗体分子的生物学活性有密切 关系： 1、选择性地通过胎盘； 2、与补体结合活化补体； 3、决定Ig分子的亲细胞性(即与带Fc受体
细胞的结合)； 4、Ig通过粘膜进入外分泌液等都是Fc片段
的功能。
补体结合位点位于CH2上；Fc受体结合
位点在CH3上。
(三)IgA 分为血清型和分泌型两种。
血清型IgA主要由肠系膜淋巴组织中的浆细 胞产生，占免疫球蛋白的10%-15%,为单 体。而分泌型IgA（sIgA）是由呼吸道、消 化道、泌尿生殖道等处的固有层中浆细胞 产生，为双体。sIgA主要存在于唾液、泪 液、以及呼吸道、消化道和泌尿生殖道黏 膜表面的分泌液中。
分泌片：由黏膜上皮细胞合成和分泌， 以非共价形式结合到二聚体上，保护IgA， 使之不受环境中酶的破坏，并介导IgA的 转运。
（二）免疫球蛋白的水解片段
木瓜蛋白酶(papain)水解IgG：得到两个相 同的Fab段和一个Fc段。
（二）免疫球蛋白的水解片段
胃蛋白酶(pepsin)裂解IgG：得到一个具 有双价活性的F（ab’）2段和若干个小 分子多肽碎片（pFc’）。
(3) 饲养细胞的准备：常用小鼠巨噬细胞 或胸腺细胞作为饲养细胞。
(4) 选择培养基：常用HAT选择培养基， H为次黄嘌呤，T为胸腺嘧啶核苷，二者 都是旁路合成DNA的原料；A是氨基喋 呤，是细胞内源性合成DNA的阻断剂。 在该培养基中，末融合的骨髓瘤细胞不 能生长，因它不能利用旁路途径合成 DNA，内源性的合成又受到氨基喋吟的 阻断；至于未融合的脾细胞则在2周内自 然死亡，所以只有融合的杂交瘤细胞才 能在该培养基中生长。
独特位：独特型由Ig可变区若干个抗原 决定簇所组成，它们被称为独特位。独 特型在异种、同种异体乃至同一个体内 均可刺激产生相应的抗体，称为抗独特 型抗体。
同种型(isotype):同一物种内所有个体共 同具有的Ig抗原特异性结构。 同种型Ig的抗原决定簇存在于CH、CL
据CH的不同，Ig分类、亚类
（三）免疫球蛋白的功能区
Ig的H链、L链每隔110个氨基酸即由链 内二硫键连接形成一个能行使特定功能 的球性单位，称为Ig的结构域或功能区 （domain）。
各功能区的作用
VH和VL:识别和结合抗原； CH和CL:同种异型的遗传
标志 CH2:补体C1q结合位点，
IgG 可通过胎盘 CH3/CH4:与多种细胞表面的
(1) B细胞的制备：可用提纯的抗原免疫 Balb/c或其他品系小鼠，免疫2-3次间隔24周，最后一次免疫后3-4d，取小鼠脾脏， 制成103/ml的脾细胞悬液，即为亲本的B 细胞。
(2) 骨髓瘤细胞的制备：用与免疫相同品系 小鼠的骨髓瘤细胞，要求其本身不能分 泌Ig，而且具有某种营养缺陷，可用 SP2/0或NS-1，它们缺少次黄嘌呤--鸟嘌 呤磷酸核糖转移酶，不能在HAT培养基 上生长。
五、免疫球蛋白的免疫原性
Ig是蛋白质，因此一种动物的Ig对另一种动 物而言是良好的抗原。 Ig抗原特异性：Fc片段是Ig分子中的重 链恒定区，因此它是决定各类Ig抗原特异 性的部位。用Ig免疫异种动物产生的抗抗 体(第二抗体)，可与相应Ig发生抗原抗体 反应 。
免疫球蛋白的不同结构区其免疫原性ห้องสมุดไป่ตู้同： 同种型（isotype）：指在同一种动物所有个 体的不同类型的Ig共同具有的抗原特异性， 同种间不表现出抗原性，只是在异种动物之 间才表现出抗原性。 Ig的同种型抗原决定 簇主要存在于重链C区。
(1)根据重链分类： 根据重链靠近羧基末端氨基酸组成及排列 顺序不同，将重链分为五种：γ、α、μ、δ、 ε 根据重链组成不同，将Ig分为五类：IgG、 IgA、IgM、IgD、IgE (2)根据轻链分型： κ、λ型
各类Ig都有κ、λ两型轻链分子。
2.可变区与恒定区
根据氨基酸排列顺序的不同分为： 可变区（V区）：氨基酸组成、排列顺序变
框架区（FR）
超变区 决定簇互补区
（CDR） Ig的抗原结合部位， 该部位也称为 CDR Ig的独特型决定簇
3. 铰链区
位于CH1与CH2之间， 含有丰富的脯氨酸， 因此易伸展弯曲，而 且易被木瓜蛋白酶、 胃蛋白酶等水解。
4. J链和分泌片
J链是一条多肽链，富含半胱氨酸，由浆 细胞合成，以二硫键的形式共价结合到Ig 的重链上。
据CL的不同，Ig分型、亚型
同种异型（allotype)：同一物种内不 同个体间的Ig免疫原性的差别。
独特型（idotype)：同一个体内不同B细 胞克隆产生的Ig其超变区各自具备独特的 抗原决定簇结构。
六、人工制备的抗体
1、多克隆抗体：多个抗原决定基——机 体——多种抗体的混合物。
2、单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）：由一个B细胞分化增殖的子代细 胞（浆细胞）产生的、针对某一特定抗 原决定簇的高度特异性抗体。
血清含量最高75%～85 %， 是介导体液免 疫的主要抗体；半衰期较长：16～24d；
主要的作用：溶解靶细胞 、促进吞噬、中
和、溶解病毒 、炎症介质作用；参与II、
III型超敏反应。
（二）IgM
为五聚体，是分子 量最大的Ig，称巨 球蛋白。
IgM激活补体、结 合抗原、免疫调理 作用比IgG强。
天然血型抗体是 IgM。
IgM的特点
IgM是个体发育中最早产生的抗体，胚 胎晚期已能合成，新生儿脐带血中若 IgM水平升高，提示胎儿曾有宫内感染。 IgM是抗原刺激后出现最早的抗体，半 衰期短，故检测IgM水平可用于传染病 的早期诊断。mIgM是B细胞抗原受体 （BCR）的主要成分,也可参与II、III 型超敏反应。
mIgM是B细胞抗原受体（BCR）的主要成分,也可参与II、III 型超敏反应(一型過敏反應：立即性過敏反應(immediate hypersensitivity reaction) 。
(5) 细胞融合 将脾细胞与骨髓瘤细胞按 一定比例(一般3:1-5:1)混合，离心后弃上 清液，然后缓慢加入融合剂50％聚乙二醇 (PEG4000)，摇动试管。静置90s，逐渐加 入HAT培养基，分于加有饲养细胞的96孔 培养板孔中，置5％-10％CO2培养箱中培 养。5d后更换一半HAT培养基，再5d后改 用HT培养基，再经5d后用完全DMEM培 养基。
化较大 恒定区（C区）：氨基酸数量、种类、排列 顺序及 含糖量都比较稳定
铰链区(hinge region)：位于CH1与CH2之 间，含有丰富的脯氨酸，因此易伸展弯
曲，而且易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水 解。
超变区（ HVR） 轻链： 24-34、50-56、 89-97 重链： 31-35、50-65、 95-102
(6) 检测抗体 杂交瘤细胞培养后，应用敏 感的血清学方法检测各孔中的抗体。视 抗原性质的不同，可采用放射免疫分析、 酶联免疫吸附试验、免疫荧光抗体技术 间接法等。通过检测筛选出抗体阳性孔。
(7) 杂交瘤细胞的克隆化：对于抗体阳性 孔的杂交瘤细胞，应尽早克隆化，一方面 是保纯：获得的杂交瘤细胞株是由一个细 胞增殖而来的，即单个克隆；另一方面防 止染色体丢失：防杂交瘤细胞因染色体丢 失而丧失分泌抗体的能力。 一般需反复克 隆3-5次方能使杂交瘤细胞稳定。克隆的方 法包括有限稀释法、显微操作法和软琼脂 平板法。
（二）B细胞杂交瘤株建立与McAb生产技 术
基本过程：B细胞的制备、骨髓瘤细胞的 制备---细胞融合---检测抗体--杂交瘤细胞 的克隆化---细胞株冻存或单克隆抗体的生 产。
单克隆抗体的问世，极大地推动了免疫 学及其他生物科学的发展，并于1984年 获得诺贝尔奖。
McAb优点 与多克隆抗体比较， McAb 具有无可比拟的优越性，具有高特异性、 高纯度、均质性好、亲和力不变、重复 性强、效价高、成本低、并可大量生产 等优点。