丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1-文档资料
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pH 4 5 6
邻氨基苯甲酸浓度g/L 0.0005 0.001 0.0015
发酵温度℃ 32 34 36
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（一）实验材料与方法
1. 试验材料：玉米秸秆、纤维素酶、及其他试剂和器材 2. 试验方法： （1） 玉米秸秆的预处理。碱浸泡法: 3%的NaOH,固液比 为1∶10,室温浸泡24 h,过滤,滤渣洗净后于60 ℃烘干水分至恒 重。氨水浸泡: 10%的氨水,固液比为1∶10,室温浸泡24h,过滤,滤 渣洗净后于60 ℃烘干水分至恒重。以不作处理玉米秸秆作为对 照。 （2） 酶水解反应条件。称取1 g秸秆于250 ml锥形瓶,加入纤维 素酶溶液(0. 05 mol/L, pH值4. 8的柠檬酸- 柠檬酸钠缓冲溶液) , 将三角瓶置于恒温水浴振荡摇床上进行酶解反应,温度50 ℃,转速 100 r/min,反应时间36 h。反应结束,离心取上清液进行还原糖的 分析。
二、丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇培养基及发酵条件优化 （一）实验设计： 1.培养基及培养方法 (1)培养基
A 种子培养基: 5%玉米醪，pH自然; B 原始发酵培养基: 葡萄糖 50 g／L KH2PO4 0.5／L 醋酸胺 3 g/ L MgSO· 7H2O 0.2g/L K2HPO4 0.5 g/ L 邻氨基苯甲酸 0.01 g/ L pH 自然 C 单因素实验发酵培养基(g/ L ):以原始培养基为基础组分，分别 改变初始糖浓度、初始pH值、碳氮比、发酵温度、转速、邻 氨基苯甲酸浓度;
糖浓度:40 、 60 、 80 、 100 、 120 g/L pH值: 4 、 5 、 6 、 7 、 8 碳氮比: 37、42、47、52、57 邻氨基苯甲酸浓度:0.0005、0.001、 0.0015、0.002、 0.0025和 0.003g/L 发酵温度:32 、 34 、 36 、 38 、 40℃ 转速: 150、160、170、180、200r/min D 正交设计实验发酵培养基(g/ L ): 培养基选取葡萄糖为碳源，醋酸按为无机氮源，并添加适 量邻氨基苯甲酸。由于培养基的碳氮比C/N、初始pH、发酵温 度以及生长因子对微生物的丙酮、丁醇合成影响很大，故对发 酵培养基的C/N ，初始pH，邻氨基苯甲酸浓度，发酵温度进行 均匀设计实验，以达到优化发酵培养基和发酵条件的目的。 按照实验设计按下表配制;
设计因素： 1.粉碎程度对酶水解的影响： 该试验采用15目、60目和200目的秸秆粉碎程 度考察粒径大小对酶水解的影响。 2. 温度对酶水解的影响： 设计30 ℃ 、35℃、40 ℃ 、45 ℃ 、50 ℃、 55 ℃。七个梯度对酶水解的影响。
3.纤维素酶的用量对酶水解的影响： 分别设置200、400、600、800、1000、1200U ／g 六个梯度。 4.pH值对酶水解的影响: 分别设置pH=3、4、5、6、7、8进行试验。 5.底物浓度对酶水解的影响： 设置固液比为1：10、1：20、1:30、1:40、1:50、 1:60、1:70几种底物浓度做试验。
丙酮丁醇梭菌 （Clostridiumacetobutylicum ）
一种革兰染色阳性、细胞呈梭状、能产生 丙酮和丁醇等溶剂的厌氧芽抱杆菌。细胞大小 (0.6一0.9)um* (2.4一4.7)um，常含细菌淀粉粒。 以周生鞭毛运动。芽抱卵圆形，次端生。表面菌 落圆形、突起，直径3一5mm，边缘不规则，色灰 白，半透明，表面有光泽。严格厌氧。能分解蛋 白质和糖类;生物素和对氨基苯甲酸作生长因子
（二） 分析方法
(1)秸秆成分分析。测定预处理前后1 g秸秆粉中的 纤维素、半纤维素及木质素含量。 (2)还原糖的测定。DNS法。 (3)酶水解率测定。
酶水解率(%) =﹛ a ×0. 9／m ×(1 - w) ﹜×100 式中, a为还原糖质量,m 为秸秆质量,w为含水率。
(三)酶水解工艺的优化
丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇 试验的研究
低成本生产丁醇的必要性
生物燃料是可替代汽油等石油燃料的清洁能源。生物燃料 主要包括生物柴油、生物乙醇和生物丁醇等。生物丁醇是一种极 具潜力的新型生物燃料，被称为第二代生物燃料。与生物乙醇相 比，它具有能量高于乙醇，有较好的燃料经济性，可提高汽车燃 料效率和行车里程数等优点。丁醇的性质更接近于烃类，因此与 汽油的配伍性好，无需改造汽车。作为新型的生物燃料，全球对 于生物丁醇的需求量逐年增加，生物丁醇的研究也因此成为当前 可再生资源开发利用的热点之一 传统发酵法生产丁醇主要以玉米和糖蜜为原料，但对中国 这样的人口大国来说，粮食关系到国计民生，确保粮食安全是社 会稳定最基本的需求。开发粮食替代资源，不与人争粮，不与粮 争地，是我国大规模生物炼制技术开发和产业发展的基本国策。
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试验内容
一、玉米秸秆水解实验设计 二、丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇培养基及发酵 条件优化
三、以玉米秸秆水解液为底物发酵产丁醇的 研究
一、玉米秸秆水解实验设计
实验研究玉米秸秆经不同试剂预处理 后对其酶水解的影响,以及pH值、时间、酶 用量、底物浓度等因素对酶水解率的影响, 从而得出最佳酶解条件。并利用最佳条件 下的水解液进行丁醇发酵,从而达到农业秸 秆的资源化利用。
原始农作物
玉米秸秆 植物秸秆主要成分是纤维素、半纤维素 和木质素。其中,纤维素、半纤维素是可发 酵糖的来源,含量占66% ～75%(纤维质原料 的绝干重量)。 但丙酮丁醇梭菌是无法直接利用木质纤 维素为底物进行丁醇发酵,它需将木质纤维 素水解产生葡萄糖、木糖等单糖再用于丁 醇发酵。
本实验所用菌种
pH 4 5 6
邻氨基苯甲酸浓度g/L 0.0005 0.001 0.0015
发酵温度℃ 32 34 36
4
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
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42 42 42 42 47 47 47 47 52 52
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（一）实验材料与方法
1. 试验材料：玉米秸秆、纤维素酶、及其他试剂和器材 2. 试验方法： （1） 玉米秸秆的预处理。碱浸泡法: 3%的NaOH,固液比 为1∶10,室温浸泡24 h,过滤,滤渣洗净后于60 ℃烘干水分至恒 重。氨水浸泡: 10%的氨水,固液比为1∶10,室温浸泡24h,过滤,滤 渣洗净后于60 ℃烘干水分至恒重。以不作处理玉米秸秆作为对 照。 （2） 酶水解反应条件。称取1 g秸秆于250 ml锥形瓶,加入纤维 素酶溶液(0. 05 mol/L, pH值4. 8的柠檬酸- 柠檬酸钠缓冲溶液) , 将三角瓶置于恒温水浴振荡摇床上进行酶解反应,温度50 ℃,转速 100 r/min,反应时间36 h。反应结束,离心取上清液进行还原糖的 分析。
二、丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇培养基及发酵条件优化 （一）实验设计： 1.培养基及培养方法 (1)培养基
A 种子培养基: 5%玉米醪，pH自然; B 原始发酵培养基: 葡萄糖 50 g／L KH2PO4 0.5／L 醋酸胺 3 g/ L MgSO· 7H2O 0.2g/L K2HPO4 0.5 g/ L 邻氨基苯甲酸 0.01 g/ L pH 自然 C 单因素实验发酵培养基(g/ L ):以原始培养基为基础组分，分别 改变初始糖浓度、初始pH值、碳氮比、发酵温度、转速、邻 氨基苯甲酸浓度;
糖浓度:40 、 60 、 80 、 100 、 120 g/L pH值: 4 、 5 、 6 、 7 、 8 碳氮比: 37、42、47、52、57 邻氨基苯甲酸浓度:0.0005、0.001、 0.0015、0.002、 0.0025和 0.003g/L 发酵温度:32 、 34 、 36 、 38 、 40℃ 转速: 150、160、170、180、200r/min D 正交设计实验发酵培养基(g/ L ): 培养基选取葡萄糖为碳源，醋酸按为无机氮源，并添加适 量邻氨基苯甲酸。由于培养基的碳氮比C/N、初始pH、发酵温 度以及生长因子对微生物的丙酮、丁醇合成影响很大，故对发 酵培养基的C/N ，初始pH，邻氨基苯甲酸浓度，发酵温度进行 均匀设计实验，以达到优化发酵培养基和发酵条件的目的。 按照实验设计按下表配制;
设计因素： 1.粉碎程度对酶水解的影响： 该试验采用15目、60目和200目的秸秆粉碎程 度考察粒径大小对酶水解的影响。 2. 温度对酶水解的影响： 设计30 ℃ 、35℃、40 ℃ 、45 ℃ 、50 ℃、 55 ℃。七个梯度对酶水解的影响。
3.纤维素酶的用量对酶水解的影响： 分别设置200、400、600、800、1000、1200U ／g 六个梯度。 4.pH值对酶水解的影响: 分别设置pH=3、4、5、6、7、8进行试验。 5.底物浓度对酶水解的影响： 设置固液比为1：10、1：20、1:30、1:40、1:50、 1:60、1:70几种底物浓度做试验。
丙酮丁醇梭菌 （Clostridiumacetobutylicum ）
一种革兰染色阳性、细胞呈梭状、能产生 丙酮和丁醇等溶剂的厌氧芽抱杆菌。细胞大小 (0.6一0.9)um* (2.4一4.7)um，常含细菌淀粉粒。 以周生鞭毛运动。芽抱卵圆形，次端生。表面菌 落圆形、突起，直径3一5mm，边缘不规则，色灰 白，半透明，表面有光泽。严格厌氧。能分解蛋 白质和糖类;生物素和对氨基苯甲酸作生长因子
（二） 分析方法
(1)秸秆成分分析。测定预处理前后1 g秸秆粉中的 纤维素、半纤维素及木质素含量。 (2)还原糖的测定。DNS法。 (3)酶水解率测定。
酶水解率(%) =﹛ a ×0. 9／m ×(1 - w) ﹜×100 式中, a为还原糖质量,m 为秸秆质量,w为含水率。
(三)酶水解工艺的优化
丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇 试验的研究
低成本生产丁醇的必要性
生物燃料是可替代汽油等石油燃料的清洁能源。生物燃料 主要包括生物柴油、生物乙醇和生物丁醇等。生物丁醇是一种极 具潜力的新型生物燃料，被称为第二代生物燃料。与生物乙醇相 比，它具有能量高于乙醇，有较好的燃料经济性，可提高汽车燃 料效率和行车里程数等优点。丁醇的性质更接近于烃类，因此与 汽油的配伍性好，无需改造汽车。作为新型的生物燃料，全球对 于生物丁醇的需求量逐年增加，生物丁醇的研究也因此成为当前 可再生资源开发利用的热点之一 传统发酵法生产丁醇主要以玉米和糖蜜为原料，但对中国 这样的人口大国来说，粮食关系到国计民生，确保粮食安全是社 会稳定最基本的需求。开发粮食替代资源，不与人争粮，不与粮 争地，是我国大规模生物炼制技术开发和产业发展的基本国策。
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0.0005 0.001 0.0015 0.002 0.0005 0.001 0.0015 0.002 0.0005 0.001
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试验内容
一、玉米秸秆水解实验设计 二、丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇培养基及发酵 条件优化
三、以玉米秸秆水解液为底物发酵产丁醇的 研究
一、玉米秸秆水解实验设计
实验研究玉米秸秆经不同试剂预处理 后对其酶水解的影响,以及pH值、时间、酶 用量、底物浓度等因素对酶水解率的影响, 从而得出最佳酶解条件。并利用最佳条件 下的水解液进行丁醇发酵,从而达到农业秸 秆的资源化利用。
原始农作物
玉米秸秆 植物秸秆主要成分是纤维素、半纤维素 和木质素。其中,纤维素、半纤维素是可发 酵糖的来源,含量占66% ～75%(纤维质原料 的绝干重量)。 但丙酮丁醇梭菌是无法直接利用木质纤 维素为底物进行丁醇发酵,它需将木质纤维 素水解产生葡萄糖、木糖等单糖再用于丁 醇发酵。
本实验所用菌种