植物细胞培养生产次生代谢产物的影响

植物细胞培养生产次生代谢产物的影响
植物细胞培养条件
温度：培养温度对植物细胞生长及二次代谢产物生成有重要影响。

通常，植物细胞培养采用25℃。

搅拌：在摇瓶实验中，通常摇床的转速取90―120r／min。

pH值：通过细胞膜进行的H+离子传递对细胞的生育环境、生理活性来说无疑是重要的。

在培养过程中，通常pH作为一个重要参数被控制在一定范围内。

植物细胞培养的适宜pH值一般为5―6。

通气：通气是细胞液体深层培养重要的物理化学因子。

好气培养系统的通气与混合及搅拌是相互关联的。

对摇瓶试验，通常500m1的三角瓶内装80―200m1的植物细胞培养液较适宜。

当然，气液传质还与瓶塞的材料有关。

试验表明，从溶氧速率考虑，以棉花塞最好，微孔硅橡胶塞次之，铝箔塞最差。

光：光对植物有着特殊的作用。

光照射条件不仅通过光照周期、光的质量(即种类、波长)而且通过光照量(光强度)的调节来影响植物细胞的生理特性和培养特性。

研究表明，光调节着细胞中的关键酶的活性，有时光能大大促进代谢产物的生成，有时却起着阻害作用。

细胞龄：在培养过程的不同时期，细胞的生理状况、生长与物质生产能力差异显著。

而且，使用不同细胞龄的种细胞，其后代的生长与物质生产状况也会大不一样。

通常，使用处于对数生长期后期或稳定期前期的细胞作为接种细胞较合适。

接种量：在植物细胞培养中，接种量也是一个影响因素。

在再次培养中，往往取前次培养液的5―20％作为种液，也以接种细胞湿重为基准，其接种浓度为15―50g(湿细胞)／L。

由于接种量对细胞产率及二次代谢物质的生产有一定影响，故应根据不同的培养对象通过试验，确定其最大接种量。

影响植物细胞培养的因素
植物细胞生长和产物合成动力学也可分为三种类型：①生长偶联型，产物的合成与细胞的生长呈正比；②中间型，产物仅在细胞生长一段时间后才能合成，但细胞生长停止时，产物合成也停止；③非生长偶联型，产物只有在细胞生长停止时才能合成。

事实上，由于细胞培养过程较复杂，细胞生长和次级代谢物的合成很少符合以上模式，特别是在较大的细胞群体中，由于各细胞所处的生理阶段不同，细胞生长和产物合成也许是群体中部分细胞代谢的结果。

此外，不同的环境条件对产物合成的动力学也有很大的影响。

1、细胞的遗传特性
从理论上讲，所有的植物细胞都可看做是一个有机体，具有构成一个完整植物的全部遗传信息。

在生化特征上，单个细胞也具有产生其亲本所能产生的次生代谢物的遗传基础和生理功能。

但是，这一概念决不能与个别植株的组织部位相混淆，因为某些组织部位所具有的高含量的次生代谢物并不一定就是该部位合成的，而有可能是在其他部位合成后通过运输在该部位上积累的。

有的植物在某一部位合成了某一产物的直接前体而转运到另一部位，通过该部位上的酶或其他因子转化。

如尼古丁是在烟草根部细胞内合成后输送到叶部细胞内的，另外有些次生物在植物某一部位形成中间体，然后再转移另一部位经酶转化而成。

因此，在进行植物细胞的培养时，必须弄清楚产物的合成部位。

同时，在注意到整体植物的遗传性时，还必须考虑到各种不同的细胞。

细胞种质影响
2、培养环境
由于各类代谢产物是在代谢过程的不同阶段产生的，因此通过植物细胞培养进行次生代谢产物生产所受的限制因子是比较复杂的。

各种影响代谢过程的因素都可能对它们发生影响，这些因素主要有光、温度、搅拌、通气、营养、pH值、前体和调节因子等。

(1)温度植物细胞培养通常是在25℃左右进行的，因此一般来说在进行植物细胞培养时很少考虑温度对培养影响。

但是实际上，无论是细胞培养物的生长或是次生代谢物的合成和积累，温度都是起着一定的作用，需要引起一定的重视。

(2)pH值植物细胞培养的最适pH值一般在5～6。

但由于在培养过程中，培养基的pH值可能有很大的变化，对培养物的生长和次生代谢产物的积累十分不利，因此需要不断调节培养液的pH值，以满足细胞的生长和产物代谢、积累的需要。

(3)营养成分尽管植物细胞能在简单的合成培养基生长，但营养成分对植物细胞培养和次生代谢产物的生成仍有很大的影响。

营养成分一方面要满足植物细胞的生生长所需，另一方面要使每个细胞都能合成和积累次生代谢产物。

普通的培养基主要是为了促进细胞生长而设计的，它对次生代谢产物的产生并不一定最合适。

一般地说增加氮、磷和钾的含量会使细胞的生长加快，增加培养基中的蔗糖含量可以增加细胞培养物的次生代谢物。

(4)光光照时间的长短、光的强度对次生代谢产物的合成都具有一定的作用。

一般来说愈伤组织和细胞生长不需要光照，但是光对细胞代谢产物的合成有很重要的影响。

有人研究了光对黄酮化合物形成的影响，结果表明，培养物在光照特别是紫外光下黄酮及黄酮类醇糖苷积累的所有酶活性均增加。

通常光照采用荧光灯，或者荧光灯和白炽灯混合，其光强度是300～10000lx(6～100μm/m2穝)可以连续光照，也可以每天光照12～18h。

(5)搅拌和通气植物细胞在培养过程中需要通入无菌空气，适当控制搅拌程度和通气量。

在悬浮培养中更要如此。

在烟草细胞培养中发现，如果K
L
a≤5h-1。

，对生物产量有明显抑制作
用。

当K
L a=5～10h-1，初始的K
L
a和生物产量之间有线性关系。

当然不同的细胞系，对氧的
需求量是不相同的。

为了加强气-液-固之间的传质，细胞悬浮培养时，需要搅动。

植物细胞虽然有较硬的细胞壁，但是细胞壁很脆，对搅拌的剪切力很敏感，在摇瓶培养时，摇瓶机振荡范围在100～150r/min。

由于摇瓶培养细胞受到剪切比较小，因此植物细胞很适合在此环
境生长。

实验室中采用六平叶涡轮搅拌桨反应器培养植物细胞，由于剪切太剧烈，细胞会自溶，次生代谢产物合成会降低。

各种植物细胞耐剪切的能力不尽相同，细胞越老遭受的破坏也越大。

烟草的细胞和长春花的细胞在涡轮搅拌器转速150r/min和300r/min时，一般还能保持生长。

培养鸡眼藤的细胞时，涡轮搅拌器的转速应低于20r/min。

因此培养植物细胞，气升式反应器更为合适。

(6)前体在植物细胞的培养过程中，有时培养细胞不能很理想地把所需的代谢产物按所想像的得率进行合成，其中一个可能的原因就是缺少合成这种代谢物所必须的前体，此时如在培养物中加入外源前体将会使目的产物产量增加。

因此，在植物细胞培养过程中，选择适当的前体是相当重要的。

对于所选择的前体除了有增加产物产量的外，还要求是无毒和廉价。

但是，寻找能使目的产物含量增加最有效的前体是有一定难度的。

虽然前体的作用在植物细胞培养中未完全清楚，可能是外源前体激发了细胞中特定酶的作用，促使次生代谢产物量的增加。

有人在三角叶薯蓣细胞培养液中加人100mg/L胆甾醇，可使次生代谢产物薯蓣皂甙配基产量增加一倍。

在紫草细胞培养中加入L-苯丙氨酸使右旋紫草素产量增加三倍。

在雷公藤细胞培养中加入萜烯类化合物中的一个中间体，可使雷公藤羟内酯产量增加三倍以上。

但同样一种前体，在细胞的不同生长时期加入，对细胞生长和次生代谢产物合成的作用极不相同，有时甚至还起抑制作用。

如在洋紫苏细胞的培养中，一开始就加入色胺，无论对细胞生长和生物碱的合成都起抑制作用，但在培养的第二星期或第三星期加入色胺却能刺激细胞的生长和生物碱的合成。

(7)生长调节剂在细胞生长过程中生长调节剂的种类和数量对次生代谢产物的合成起着十分重要的作用。

植物生长调节剂不仅会影响到细胞的生长和分化，而且也会影响到次生代谢产物的合成。

生长素和细胞分裂素有使细胞分裂保持一致的作用，不同类型的生长素对次生代谢产物的合成有着不同的影响。

生长调节剂对次级代谢的影响随着代谢产物的种类的不同而有很大的变化，对生长调节剂的应用需要非常慎重。

目前，在大规模植物细胞悬浮培养中，为了提高生物量和次生代谢产物量，一般采用二阶段法。

第一阶段尽可能快地使细胞量增长，可通过生长培养基来完成。

第二阶段是诱发和保持次生代谢旺盛，可通过生产培养基来调节。

因此在细胞培养整个过程中，要更换含有不同品种和浓度的植物生长激素和前体的液体培养基。

为了获得能适合大规模悬浮培养和生长快速的细胞系，首先要对细胞进行驯化和筛选，把愈伤组织转移到摇瓶中进行液体培养，待细胞增殖后，再把它们转移到琼脂培养基上。

经过反复多次驯化筛选得到的细胞株，比未经过驯化、筛选的原始愈伤组织在悬浮培养中生长快得多。

毋庸置疑，在过去几十年中，植物生物技术方面已取得了相当巨大的进展，大大缩短了向工业化迈进的距离。

国内有关单位对药用植物，人参、三七、紫草、黄连、薯蓣、芦笋等已展开了大规模的细胞悬浮培养，并对植物细胞培养专用反应器进行研制。

国外，培养植物细胞用的反应器已从实验规模1～30L，放大到工业性试验规模130～20000L，如希腊毛地黄转化细胞的培养规模为2m3，烟草细胞培养的规模最大已达到20m3。

值得注意的是影响植物细胞培养物的生物量增长和次生代谢产物积累的因素是错综复杂的，往往一个因素的调整会影响到其他因素的变化，所以，需要在培养过程中不断加以调整，同时，由于不同的植物有机体有自身的特殊性。

因此，对于一种植物或一种次生代谢物适合的培养条件，不一定对其他的细胞或次生代谢作用适合。

植物细胞培养是指在离体条件下培养植物细胞的方法。

将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中，进行振荡培养，使组织分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，获得大量的细胞群体。

小规模的悬浮培养在培养瓶中进行，大规模者可利用发酵罐生产。

. 利用植物细胞培养生产代谢产物具有十分广阔的前景。

. 植物细胞培养条件优化
目前植物细胞培养生产的化合物很多，包括糖类、酚类、脂类、蛋白质、核酸以及帖类和生物碱等初生和次生代谢产物，植物细胞培养的应用主要包括以下3个方面：有用物质（次生代谢产物）的生产；植物无性系的快速繁殖和遗传突变体的筛选；植物细胞遗传、生理、生化和病毒方面的深入研究。

但是由于植物细胞大规模培养技术的局限性使得植物细胞仍难以实现大规模工业化生产，迫切需要进一步研究和发展细胞培养条件的优化控制及其工艺。

1 植物细胞悬浮培养条件的优化
1.1 植物细胞培养过程中物理因素的优化控制对于植物细胞培养来说，环境中的许多物理因素对细胞的生长以及目标次生代谢产物的合成具有很大的影响。

如通过温度、光照、电场、磁场电磁辐射、机械力以及超声波等对于植物细胞培养过程都有着十分重要的作用。

植物细胞的生长、繁殖和次生代谢物的生产需要一定的温度条件，在一定的温度范围内细胞才能正常生长、繁殖和维持正常的新陈代谢，植物细胞培养的最适温度一般为25℃，但不同的植物种类略有差异，而且植物细胞生长和次生代谢产物的合成所需的温度并不一致，因此选择合理的培养温度并进行相应的调控对于细胞生长以及产物合成十分关键
1.2 植物细胞培养过程中化学因素的优化控制植物细胞培养过程中的一些化学因素如培养基组成、溶氧、其它添加物等对于细胞的生长也具有十分重要的意义。

合理的培养基组分、适当的溶氧以及其它诱导子及其前体等物质的有效调控能够在很大程度上促进细胞的生长以及次生代谢物的合成。

培养基中的碳源、氮源及其一些微量的金属离子以及一些有机物质不仅是细胞生长以及合成的物质基础，而且很多都能够促进细胞生长或者是有利于产物的形成。

植物细胞培养通常使用蔗糖作为碳源，研究表明，一定浓度的蔗糖不仅能够促进植物细胞的生长，还能够刺激次生物质的合成，
2 植物细胞培养相关模型的研究进展
利用植物细胞培养生产药物，已发展成植物细胞培养在生产运用中的主流之一。

目前全世界约有四分之三的人以植物作为预防疾病的药物来源。

因葡萄球菌、大肠杆菌、结核杆菌等都表现出对由微生物来源的各种抗生素的耐药性，人们对抗生素类药的局限性已有了深刻的认识。

植物产生的药物在微生物中很少发现，而且植物产生的药能克服微生物来源药物的诸多不足，而化学合成药物的难度又远远超过了从植物中获得天然产物。

然而由于药用植物的过度采伐，其资源日趋贫乏，同时对环境也造成了极大的破坏，因此为了解决植物资源短缺、环境保护等问题，药用植物细胞的大量培养显得十分重要。

目前国内外在药用植物细胞培养方面的研究取得了很大进展，特别是运用生物反应器进行药用植物细胞大量培养的技术正日趋成熟。

在植物细胞放大培养的过程中最关键的问题是建立对培养过程中各种现象进行合理描述的模型, 为细胞的大量培养奠定基础。

目前国内外在植物细胞培养过程动力学模型的研究方面取得了很大的进展。

植物细胞培养始于20世纪初, 运用生物反应器对植物细胞进行大量培养的报道最初始于1960年，Tuleche和Nickel运用134L的生物反应器成功培养了不同种类的植物。

但
由于植物细胞固有的性质代谢途径和代谢产物与细胞生长关系的复杂性，细胞与培养环境相互作用，使得对植物细胞的放大培养变得难以实现，只有针对不同的植物细胞，采用相应的简化策略建立细胞培养模型，逐级模拟和优化培养过程才能够最终实现细胞的大量培养。

现分别就近几年关于植物细胞培养过程的动力学模型的研究进展进行归纳。

2.1 植物细胞培养非结构化动力学模型最初植物细胞培养的数学模型的建立是在细菌等微生物培养过程动力学模型的基础上发展起来的。

在传统的微生物发酵过程中通常都是以一个简单的生物量组分来进行模型化，因此都是非结构化的，如Monod模型、Nyholm模型及其Leudeking-piret模型等，这些类型的模型通常都只能够考虑一些单组分的变化情况，而不能够考虑到植物细胞组分的多样性和细胞在培养过程及其代谢过程中变化的复杂性，如次生代谢产物的生成和细胞生长以及细胞在代谢过程中其它中间物质之间的相互转化的复杂关系等。

因此这类模型不能够预测植物细胞培养过程中的很多行为，对于植物细胞的放大培养的指导性也十分有限。

2.2植物细胞生物反应器培养
自从1960年Tuleche和Nickle首次报道在134L生物反应器中成功培养不同植物种类以来，利用植物细胞大规模培养技术为植物有用代谢产物的生产提供了有效途径和生产方法。

由于植物细胞固有的性质，如细胞容易聚集、细胞分化、细胞十分脆弱以及代谢途径和代谢产物形成与细胞生长关系复杂，因此在植物细胞培养时选择合适的反应器类型及操作方法极大地关系到植物细胞代谢产物的合成。

利用生物反应器来培养植物细胞相对与利用摇瓶来讲有两大优势,首先可以更好的控制反应系统(比如pH值和溶氧浓度可以在线监控等)；第二点优势在于许多生物反应器可以放大，可以更好的运用于大规模的工业化生产。

运用于植物细胞培养的生物反应器主要有：搅拌式反应器、气升式反应器、鼓泡式反应器、膜反应器、光照培养反应器和转鼓式反应器等。

各种反应器都有自身的特点和优点，在选用反应器时要根据不同的植物细胞特点选取相应的反应器类型。

在运用反应器培养植物细胞时反应器的操作策略也是多样的，如间歇培养、流加操作、连续培养和两段培养等。

但在反应器培养时主要考察的参数是系统的溶氧速率以及其调控方式的优化。