水蛭

水蛭素研究进展

水蛭与健康2008-05-12 12:36:10 阅读2 评论0 字号：大中小

作者：许可(综述)；舒翠玲（审校）

关键词：水蛭素；凝血酶抑制剂；抗凝血；抗血栓

水蛭素（Hirudin）是一种有效的凝血酶直接抑制剂，对于凝血酶具有高度的亲合性和特异性，在基础研究和临床应用上备受关注，被认为是2010年前最强的可逆性凝血酶直接抑制剂。本文主要从水蛭素的组成与结构、药理作用、临床作用等方面进行了概述。我们认为，在不久的将来，水蛭素在疗效上可以超过肝素等目前广泛使用的抗凝血药物，而成为一类抗凝血、抗血栓新药。

1 简介

人类利用水蛭的历史可以追溯到远古时代。但直到1904年其抗凝组分－水蛭素(Hirudin) 才由Jocoby等人分离出来。1955年Markwardt获得了水蛭素纯品，并于1957年确定其为含65个氨基酸的多肽。上世纪八十年代生物学家完成了对水蛭素的二级结构和三级结构的分析。

1986年Harvey等［1］应用分子生物学技术获得编码水蛭素的cDNA基因，使重组水蛭素的大量制备成为可能，水蛭素的开发研究由此得到迅速发展。上世纪九十年代水蛭素进入了临床研究阶段，至今，共有三种水蛭素类药物获得了美国食品和药品管理局（FDA）的上市许可。

2 组成与结构

2．1 天然水蛭素

天然水蛭素从医用水蛭（Hirudo medicinalis L.）的组织中提取，经离子交换、凝胶过滤或亲合层析等获得。天然水蛭素是一种单链环肽化合物，由65～66个氨基酸残基组成，相对分子量约为7kDa［2］。其N端含有3对二硫键(-S-S-)，分别位于Cys6…Cys14、Cys16…Cys28、Cys22…Cys39，从而使肽链N端绕迭成密集形核心环肽结构（见图1）。C端富含酸性氨基酸，其中63位的酪氨酸被硫酸化［3］。

图1 水蛭素的核心环肽结构

天然水蛭素不是均一蛋白，存在十几种异构体，但具抗凝血酶活性的仅有HV1、HV2和HV3三种。由于提取的部位不同使他们的活性存在差异，从口部提取的HV2活性最高，从头部提取的HV1活性次之（仅为口部的22 ％），HV3从身体其他部位提取，活性最低。

这些异构体都不含精氨酸、色氨酸和蛋氨酸，它们具有较高的同源性和基本相似的一级结构，具有相似的抗凝活性。核磁共振研究表明，这些变异体均没有α螺旋结构，位于N端的5个氨基酸残基为疏水基团，C端则为亲水基团，游离在分子的表面。研究认为水蛭素肽链的二级和三级结构对其抗凝活性起决定性作用，其N端的3对二硫键是决定分子二级和三级结构及其稳定性的关键，如果二硫键氧化或发生蛋白降解，水蛭素将失去抗凝活性。而如果C端羧基被酯化，或失去C端氨基酸，水蛭素也会失去结合凝

血酶的能力［4］。

2．2 重组水蛭素（recombinant hirudin, rH）

1986年Harvey等从水蛭组织中扩增出编码水蛭素的cDNA［1］，并在大肠杆菌细胞中成功表达，获得重组水蛭素r-HV2，这一开创性工作引起了广泛的兴趣和重视，成为基因工程和抗血栓领域的一大热点。随后，r-HV2在酵母体系中表达成功，r-HV1在大肠杆菌和酵母中也表达成功［5］。后来的研究证明，从不同生物系统中获得的重组水蛭素与天然水蛭素相比，除了缺乏Tyr63位的硫酸基外，两者的组成和构型大致相同，它们的药理作用和生物活性无明显的差别。

3 药理作用

水蛭素是迄今所知最强的凝血酶抑制剂，1 μg即可中和5 μg凝血酶，相应摩尔数比为1:1［6］。水蛭素与凝血酶结合后形成了一种非共价复合物，该复合物解离常数为10-10，且反应速度极快［4］。

3．1 抗凝血作用

水蛭素通过和凝血酶直接结合而发挥抗凝血作用。凝血酶是血液凝固、止血过程和血栓形成的中心酶之一。它专一性地水解纤维蛋白原上的Agr－Gly键，使之转变成纤维蛋白；纤维蛋白相互作用会进一步形成血栓。凝血酶由A，B两条链构成，有3个结构域：（1）位于B链Ser195的活性部位；（2）位于活性部位附近的底物结合槽；（3）由碱性氨基酸组成的纤维蛋白原识别部位，又称阴离子结合外部位

（anion－binding exosite，ABE）。

研究表明：水蛭素对凝血酶的作用是分两步进行：（1）凝血酶带正电荷的非催化位点部分，与水蛭素带负电荷的C端形成初始结合体，该步是反应的限速步骤，其反应速度取决于离子强度；（2）结合体通过控制扩散，迅速重排形成同凝血酶活性位点紧密结合的复合物。在该复合物中，C端结合在凝血酶的纤维蛋白原识别位点，抑制凝血酶对纤维蛋白原的激活作用。N端则同凝血酶催化位点结合，抑制凝血酶的催化作用。靠近凝血酶催化位点附近的精氨酸侧链袋（Arg Side Chain Pocket）中带负电荷的碱基，同水蛭素47位赖氨酸残基发生作用。由于Lys47被两侧的脯氨酸所包围，这一特殊三肽段Pro-Lys-Pro 一般不容易被蛋白酶降解，也很难在反应中断裂，其稳定性具有重要的生物学意义［7］。

水蛭素不仅能阻止纤维蛋白原的凝固，亦可阻止凝血酶催化的进一步血瘀反应，如对凝血因子Ⅴ、Ⅷ的活化及凝血诱导的血小板反应等均存在抑制作用。血液凝固的被推迟或完全被阻止取决于水蛭素的浓度［8］。水蛭素还可抑制凝血酶诱导成纤维细胞的增殖和凝血酶对内皮细胞的刺激，同时抑制凝血酶同血小板的结合以及血小板受凝血酶刺激后的释放，并可使两者解离。

3．2 抗血栓作用

诱导血管内血栓形成虽有多种因素，但凝血酶诱发的血液凝固是血栓形成的主要触发机理。在血栓形成过程中凝血酶与纤维蛋白结合形成结合凝血酶，结合凝血酶能始终保持酶活性，不能被循环中的抑制剂灭活。它具有以下作用：（1）强烈的致血栓形成作用，血管中形成的血栓是结合凝血酶的储藏库，能不断刺激新血栓形成，又通过激活血小板和凝血因子Ⅴ、Ⅷ放大凝血反应；（2）激活ⅩⅢ因子，通过纤维蛋白的交叉相连，及纤维蛋白与α2抗纤维蛋白溶酶的交叉相连，使血栓不能被溶解；（3）可能激活碳氧多肽酶B（凝血酶激活纤维蛋白溶解抑制剂，TAFI），其一旦被激活，将减弱纤维蛋白的降解；（4）凝血酶还能与可溶性的纤维蛋白降解产物结合，使其不能被抑制剂灭活。当药物溶栓时，纤溶系统被激活，凝血系统也同时被激活。在这一过程中，通过激活接触因子和Ⅴ因子，能产生大量结合凝血酶。因此在治疗血栓过程中，抑制凝血酶的产生，并阻断其激活具有重要意义。

靶向凝血酶的药物，可防止血纤蛋白和血细胞结合形成血凝块。由于水蛭素分子小，可渗透至血栓内对与血栓结合的凝血酶起作用，因而它不但能抑制游离的凝血酶，更能有效地抑制凝血块上的凝血酶，

可防止各类血栓的形成及延伸。