食品卫生微生物学检验 沙门氏菌检验

2） 生化鉴定项目进行调整（续） 为保持与原标准的一致性，本标准也保 留了可以同时直接接种蛋白胨水 (供做靛基 质试验)、尿素琼脂 (pH7.2)、KCN 培养基 的内容。本部分还增加了对疑似菌落进行 留样确认的部分，以备必要时复查，这对 生化鉴定不确定的菌落进行进一步验证是 非常必要的。
第1位数
35℃ or 37℃ 20~24h 典型菌落（pink red） 营养琼脂纯化可疑菌落 35℃ or 37℃ 18~24h TSI，尿素酶，赖氨酸脱羧酶，ONPG，VP，吲哚 无典型菌落再培养18～24h
血清学试验 （O抗原，Vi抗原，H抗原） 报告结果 送参考实验室分型
1 前增菌 2 选择性增菌 3 分离 4 鉴定 5 报告
第6位数
R G A 1 + 1 S A C 2 0 5 M E L 4 + 4
第7位数
A M Y 1 0 2 A R A 2 + 2 O X
A L D D H C 2 4
结 果 判 定
2 4 + + 2 4 7
1 0
4 0
0
+ + 2 6 4
+ + 2 7 4
沙 门 菌
沙门氏菌20E鉴定结果
布氏柠檬酸杆菌20E鉴定结果
沙门氏菌检验程序
1 取消样品分类，前增菌液统一为“缓冲蛋白胨 水” 原国标：BPW FDA、AOAC：多种前增菌液 ISO：BPW
2 对所有样品均进行8-18h前增菌 原国标只对冻肉、乳品、蛋品等加工食品进 行前增菌，FDA、AOAC、ISO、Canada MFHPB、CCFRA等组织或国家对所有样品都 进行前增菌。
VIDAS（生物梅里埃公司） BAX （杜邦公司）
VIDAS 应用酶联免疫技术制造的全自动免疫 分析仪 ，用荧光分析技术通过固相吸附 器，用已知抗体来捕捉目标生物体，然 后以带荧光的酶联抗体再次结合，经充 分冲洗，通过激发光源检测，即能自动 读出发光的阳性标本，其优点是检测灵 敏度高，速度快，可以在48小时的时间 内快速鉴定沙门氏菌、大肠杆菌O157： H7、单核李斯特菌，空肠弯曲杆菌和葡 萄球菌肠毒素等。
1. GB/T 4789.4 2. AOAC Official Method ：967.26， 967.27，967.28 3. ISO ：6579 4 . USFDA ： Bacteriological Analytical Manual, Chapter 5: Salmonella。
1 前增菌； 2 选择性增菌； 3 分离； 4 生化鉴定； 5.血清学鉴定； 6.报告。
马群飞
QFMA@
非沙门氏菌
细菌学分析手册（FDA/BAM）
样品（20类）25g
225mL 乳糖肉汤（LB）or 胰酪胨大豆肉汤（ TSB）or 煌绿溶液 （BG）or 通用前增菌肉汤（UPB）or营养肉汤（NB）or 再造脱脂奶粉 or 四硫酸盐煌绿（TT） pH6.8±0.2 24±2 h 35℃ TT 43±0.2℃ or 35±2.0℃ 24±2h BS RV 24±2h 42±0.2℃
65.3 81.0 52.0 83.2 80.0 83.0 86.2 106.6 77.7 68.4 98.4 71.6 100.0
I： 进口 C：国产
SS琼脂 上面的志 贺氏菌和 沙门氏菌
C-BS
I-BS
C-HE

I-HE
I-XLD
C-XLD（变形菌落-错误）
I-XLD
样品+BPW+SC+BS
& XLD & HE
24±2h 35℃ TSI & LIA LIA+ LIA－ TSI K/A LIA－ TSI A/A 非沙门菌 （API 20E, Enterotube II, Enterobacteriaceae II,MICRO-ID, or Vitek GNI） +O抗原&H抗原
尿素酶，H抗原（多价H抗血清或SpicerEdwards flagellar (H) test ），赖氨酸脱羧酶， 酚红卫矛醇肉汤，色氨酸肉汤（KCN， 丙二酸盐，吲哚），O抗原 酚红乳糖肉汤，酚红蔗糖肉汤，MR－VP,西蒙氏柠檬酸盐
修订任务由卫生部全国食品卫生标准委员会 下达，由微生物标准协作组具体实施。 2. 兄弟单位、企业、公司为参与单位。 3. 共采集到数据800多个，专家反馈意见50余 条（采纳90%以上）条，形成标准的草案 稿、送审稿。 4 . 时间跨度2004年—2006年 1.
结合目前的国际标准和原标准的实际使用情况， 针对原标准的修订，我们遵循以下的修订原则： 1．以原国标为基础，保持与原标准的连续性； 2．参照国际分析协会（AOAC）、国际标准组织 （ISO）及美国食品药品管理局（FDA）的有关标 准； 3．结合标准的比对实验和验证实验，积极吸取新方
AOAC 967.25－967.28
处理样品 35℃ 1mL+10mLSC 35℃ 24±2h XLD & HE & BS 35℃ TSI 35℃ 纯培养物 尿素酶＋ 非沙门菌 尿素酶－ 24±2h（BS 24h&48h） & LIA 24±2h 不纯培养物 MAC or XLD or HE 纯培养物 非 沙 门 菌 非 沙 门 菌 24±2h 1mL+10mLTT
使用BS、XLD、HE、科玛嘉显色培养基
原国标：BS、DHL（或HE、WS、SS） FDA：BS、XLD、HE AOAC：BS、XLD、HE ISO：phenol red brilliant green琼脂、BS或HE
为了最大可能的检出沙门氏菌，原则上必 须使用两种以上选择性分离培养基。
I-SS I-SS-M C-SS I-HE C-HE I-XLD C-XLD I-BS C-BS CHRO C-DHL C-WS TSA（对照）
H抗原，LIA，酚红卫矛醇肉汤，色氨酸肉汤 （KCN，丙二酸盐，吲哚），O抗原 补充生化试验
沙门菌
酚红乳糖肉汤，酚红蔗糖肉汤，MR－VP,西蒙氏柠檬酸盐
ISO 6579:1993(E)
微生物－沙门菌检测的通用方法
25g样品 225mL BPW 35℃ or 37℃ 16~20 h 0.1mL+10mL RV 42℃ 24h 酚红煌绿琼脂 （亮绿琼脂） & 10mL+100mL SC 35℃ or 37℃ 24h,48h 第二种选择性平板
10mL＋MM （或TTB）100mL 42 ℃ 18h～24h
10mL＋SC100mL 36 ℃ ± 1 ℃ 18h～24h
检样匀液25mL ＋MM （或TTB）100mL 42 ℃ 18h～24h
检样匀液25mL ＋SC100mL 36 ℃ ± 1 ℃ 18h～24h
BS 36 ℃ ± 1 ℃ 40h～48h
河生肠杆菌20E鉴定结果
应用一系列小的多孔的聚苯乙烯卡片进行测试， 卡片含有干燥的抗菌药物和生化基质。先制备一定 浓度的欲鉴定菌株的菌悬液，然后将菌悬液接种到 各种细菌的小卡上，将其放入具有读数功能的孵箱 内，每隔一定时间，仪器会自动检测培养基的发酵 情况，并换算成能被计算机所接受的生物编码。最 后由计算机判定，打印出鉴定结果。
O N P G 1
反应 结果 应得 树枝 组合 编码
第2位数 第3位数
O D C 1 + 1 C I T H U 2 R S E 1 0 T D A 2 0 0 I N D 4 0
第4位数
V P G E L 2 0 4 G L U 4 + 4
第5位数
M A N 1 + 1 I S N O O R 2 4
DHL（或HE、WS、SS） 36 ℃ ± 1 ℃ 18h～24h
TSI（排除A/A H2S－结果 ），靛基质，尿素，KCN，赖氨酸
H2S＋ 靛＋ 尿－ KCN－ 赖＋ 甘露醇 沙门氏菌血清学试验 山梨醇
H2S－ 靛－ 尿－ KCN－ 赖＋/－ ONPG － 沙门氏菌
非如左述的各种反应结果
沙门氏菌血清学试验
国家标准 USFDA FSIS AOAC ISO
中华人民共和国国家标准
GB/T 4789.4-2003
冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品
鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品
前增菌法 25g＋BPW225mL 36 ℃ ± 1 ℃ 一般4h，干蛋品18h～24h
直接增菌法 25g＋灭菌生理盐水25mL
DUPONT Qualicon BAX System 应用DNA分子核酸探针或基因探针技 术制造的全自动PCR分析仪。将已知核 苷酸序列DNA片段用同位素或其他方法 标记，加入已变性的被检DNA样品中， 在一定条件下即可与该样品中有同源序 列的DNA区段形成杂交双链，从而达到 鉴定样品中DNA的目的。
沙门菌
非沙门菌
USDA/FSIS MLG 4.02
样品
BPW or BPW（含结晶紫） 35±1℃ 0.5 ± 0.05mL ＋10mL TT 42± 0.5℃ 22~24h BGS & 20-24h 0.1 ± 0.02mL ＋10mL mRV 42± 0.5℃ 22~24h DMLIA or XLT4
I-BS
C-BS
C-BS
I-BS
I-BS
C-BS
C-HE
I-HE
I-HE
C-HE
I-HE
C-HE
1） 采纳API 20E®或Vitek GNI®为传统 生化鉴定方法的选择性替代方法”。
2） 生化鉴定项目进行调整 原国标中生化鉴定是将可疑菌落同时接种于
三糖铁（TSI）琼脂、蛋白胨水 (供做靛基质试验)、尿素琼 脂 (pH7.2)、氰化钾 (KCN) 培养基和赖氨酸脱羧酶试验培 养基； 现修改为：在接种TSI琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养 基的同时增加一项营养琼脂（NA），经TSI琼脂和赖氨酸 脱羧酶试验培养基的选择后，可筛掉大部分非沙门氏菌 株，大大减少了工作量，同时也满足了API 20E®或Vitek GNI®鉴定的需要。
GB/T4789.4 食品卫生微生物学检验
修订背景 国内外方法 修订内容
– 前增菌 – 选择性增菌 – 分离平板 – 生化鉴定 – 血清学鉴定 – 报告
由于食品生产及流通的全球化、新的食品加工技 术的应用、东西方饮食习惯的交融、自然环境的改 变等因素的影响，目前沙门氏菌污染的食物种类、 季节及场所发生了重大变化。同时，随着检测技术 的发展，对于沙门菌的快速检测方法层出不穷，有 些方法已通过国际权威机构认证（如AOAC）成为 了国际标准方法。
3 修改了样品处理方式 增加拍击式均质器，均质袋可直接培养。 4 增加调整pH值
1 使用“TTB、SC”，取消“MM”
原国标：“MM或TTB、SC AOAC：TT、SC FDA：RV、TT ISO：RV、SC
选择性增菌的目的是最大可能的检出沙门氏菌， 原则上必须使用两种选择性分离增菌液，一种是抑 制除沙门氏菌以外其肠道菌的生长，一种是在不影 响其他肠道菌生长的情况下促进沙门氏菌的生长。
35± 1℃ 18~24h & 48h TSI & LIA 血清学试验
商业生化试剂盒或自动鉴定系统 or 传统生化鉴定
报告结果
AOAC Official Method 967.25 Salmonella in Foods Preparation of Culture Media and Reagents AOAC Official Method 967.26 Salmonella in Processed Foods Detection AOAC Official Method 967.27 Salmonella in Foods Identification AOAC Official Method 967.28 Salmonella in Foods Serological Tests
1 血清学鉴定中的菌体分群为选择性试验 项目
原国标进行O抗原、H抗原鉴定及菌体分群； FDA、AOAC进行O抗原、H抗原鉴定，菌体分 群为选择性； ISO进行O抗原、H抗原鉴定。
综合以上生化试验和血清学鉴定的结 果,报告25g样品中检出或未检出沙门氏 菌。
选择性增菌液的配置 分离培养基的质控 疑似菌落的挑选 API 20E 结果判读 血清质量