氨基酸的纸色谱分离

氨基酸的纸色谱分离

一、目的要求

1、了解纸色谱的基本原理；

2、学习用纸色谱分离氨基酸的一般操作。

二、基本原理

在平面上进行分离的一种色谱方法纸色谱，主要包括纸色谱法和薄层色谱法。纸色谱是一种分配色谱，以滤纸作载体。滤纸是由纤维素组成，纤维素上有多个—OH，能吸附水（一般纤维能吸附20%~25%水份），作为固定相，与水不相混溶的有机溶剂作为流动相。当样品点在滤纸一端，放在一密闭器中，让流动相通过毛细管作用从滤纸一端，经过点样点流向另一端，样品中溶质在固定相水、流动相有机溶剂中进行分配，因样品中不同溶质在两相中分配系数不同，容易溶于流动相中而难溶于水中的组份，随流动相往前移动速度快些，而易溶于固定相，难溶于流动相的组份，随流动相向前移动速度慢些，从而达到将不同组份分离的目的。也可用测定R f值方法对不同组分进行鉴定。

纸色谱常用作多官能团或极性较大的化合物，如糖类、酯类、生手碱、氨基酸的分离。它因为设备简单、试剂用量少、便于保存，而为实验室常用方法。

纸色谱的操作方分为滤纸和展开剂的选择、点样、展开、显色和结果处理（测量R f值）五个部分。

三、仪器、药品

仪器：圆形滤纸（直径125mm）、培养皿一套、毛细管、电吹风、剪刀、直尺、铅笔、边长约2.5cm的普通滤纸。

药品：标准液（1%亮氨酸/乙醇溶液、1%赖氨酸/乙醇溶液），样品混合液（含亮氨酸、赖氨酸的乙醇溶液），0.1%茚三酮乙醇溶液，展开剂（正丁醇∶冰乙酸∶水=4∶1∶5，在分液漏斗中充分混合，静止分层，取上层作展开剂）。

四、实验步骤

1、点样

取16cm×6cm的中速色谱纸在距离底边2cm处用铅笔划起始线，在其电线上分别点上标准品(亮氨酸、赖氨酸)及混合样品溶样（样点间距1cm），点样直径

控制2mm~4mm，然后将其晾干。

注意: 滤纸的选择与处理

（1）滤纸要求质地均匀、平整、边沿整齐、无折痕、有一定机械强度；

（2）滤纸纸质要求纯度高、无杂质，无明显萤光斑点，以免与色谱斑点相混淆；

（3）滤纸纤维松紧要适宜，过紧则展开太慢，过松则斑点扩散。实验室用的滤纸可适用于一般的纸色谱分析。严格的研究工作中则需慎重选择层析用纸，并进行净化处理。例如分离酸性、碱性物质时，为保持恒定的酸碱度，可将滤纸浸泡在一定pH值的缓冲液中，进行预处理后再用。

2、展开

向色谱缸中加25ml展开剂，盖上盖子约5min（使缸内展开剂蒸气饱和），将点样后的滤纸悬挂在缸内使纸底边浸入开展剂约0.3cm~0.5cm，待溶剂前沿展开到合适部位（约8cm~10cm），取出，划出前沿线。

注意: 纸色谱必需在密闭的层层析缸中展开。在层析缸中加入适量的展开剂，将点好样的滤纸放入缸中。展开剂水平面应在点样纸以下，绝不允许浸泡样品线。

3、显色

当展开剂移动到离纸边沿约1~2cm时，取出滤纸，用铅笔小心划出溶剂前沿，然后冷风吹干。将展开完毕的滤纸，用烘箱烘干后，使展开剂挥发。用喷雾器将显色济0.1%茚三酮乙醇溶液均匀地喷洒到滤纸上，或用小滴管涂茚三酮到滤纸上。然后用热风吹干滤纸，直到斑点显色为止。也可置石棉网上方，小心用洒精灯烘烤，至斑点显色。画出斑点位置及颜色最深处，根据原点到斑点颜色最深处距离，原点到溶剂前沿距离，计算R f值。

原点

溶剂前沿

斑点

图纸色谱图

4、计算比移值R f

操作流程：

五、注意事项

1.吸样后的毛细管要垂直落在层析纸点样处，样点大小要基本一致；

2.样点不要浸在展开剂中；

3.点样毛细管不要张冠李戴，不要乱丢，用后随即放回原瓶；

4.喷显色剂时，使层析纸湿润即可，切勿流淌，并迅速吹干；

5.在层析纸制作、点样、显色、吹干及Rf值测定等操作过程中，手只能拿最上端，以防被手玷污。