病原细菌的分离与鉴定

病原细菌的分离与鉴定.txt24生活如海，宽容作舟，泛舟于海，方知海之宽阔；生活如山，宽容为径，循径登山，方知山之高大；生活如歌，宽容是曲，和曲而歌，方知歌之动听。病原细菌的分离与鉴定

发布日期：2009-05-09 浏览次数：827 字号：[ 大中小 ]

一、实验目的

系统学习兽医临床病原细菌的分离与鉴定技术，促进学生系统掌握各类病原细菌的基本特性与实验诊断技术，增强学生应用所学知识解决生产实践过程中的传染病的诊断和防控问题的能力，为预防、控制和消灭畜禽病原微生物，保障畜牧业生产的健康发展服务。

二、知识背景

细菌分离是细菌学检验中的极其重要的环节。正确的分离有助于很快得到可疑的致病菌，对疫病的诊断与防控至关重要。在细菌分离时应注意的事项：

1．病料采集

（1）病料的种类主要决定于疫病的性质，一般方法为：

①全身感染→血液及内脏；

②局部感染→病患部位；

③特殊病例→特殊处理。特殊情况的正确处理与操作者的专业知识有很大关系。无论全身或局部感染，均应采含菌最多或病变明显的组织

（2）病料的采集时间也应特别注意：

①活体病料→应考虑病原在疾病发展过程中部位的变化；

②患畜死后→应立即采集病料，越早越好。

2．无菌操作

无菌操作是指在微生物研究过程中，既要避免各种外界的微生物进入操作对象又要杜绝操作对象污染周围环境的操作技术。

无菌操作是对微生物学工作者最基本的要求，必须经过严格训练才能形成无菌操作素养。不论何种情况下，头脑中都应该有这个概念。

无菌操作贯穿于整个分离过程，例如：病料的采集、器材的准备、具体的操作。所用器械及物品均应事先灭菌备用，金属器具包装后高压灭菌或煮沸30min，玻璃器皿可高压灭菌也可

干热灭菌，胶皮塞、培养基等则要高压灭菌。

3．培养基

培养基是指由人工方法配合而成的，用于微生物培养、分离、鉴别、研究和保存菌种用的混合营养制品。

（1）制作培养基的基本原则

依据细菌的物质代谢要求和营养需要，必须含有细菌生长繁殖所需要的碳源、氮源、矿物质以及生长环境条件。

（2）制作培养基的基本要求

①适宜的水分和各种营养物质；

②适宜的酸碱度与渗透压；

③不含抑制细菌生长的物质；

④应均质透明；

⑤应彻底灭菌；

⑥对某些微生物必须提供一些特殊物质。

（3）培养基的种类

①基础培养基：含有一般细菌生长繁殖需要的基本营养物质；可作为一些特殊培养基的基础成分。

②加富培养基：在基础培养基中加入某些特殊营养物质（如血液/血清、酵母浸膏或生长因子等）；用以培养对营养要求高的微生物。

③选择培养基：利用细菌对某种或某些化学物质的敏感性不同；在培养基中加入这类物质，利于所需分离的细菌生长，而抑制不需要的细菌生长，从而达到分离某种微生物的目的。

④鉴别培养基：是一类含有某种特定化合物或试剂的培养基。某种细菌在这种培养基上培养后，产生某种代谢产物，能与这种特定化合物或试剂发生某种明显的特征性反应；从而达到区分不同的微生物。

⑤厌氧培养基：利用物理、化学或生物学方法，去除氧气后的培养基；可用于厌氧性细菌的分离和培养。

4．细菌在培养基上的生长情况

（1）固体培养基

单个细菌在培养基表面生长、繁殖到一定程度时形成的肉眼可见的子细胞群落称为菌落，它是由数以万计相同的细菌集合而成。众多细菌在固体培养基表面密集生长所形成的细胞群体称为菌苔。

①菌落的形态特征

大小、形状（露滴状、圆形、菜花样、不规则等）、突起或扁平、凹陷、边缘（光滑、波形、锯齿状、卷发状等）、颜色（红色、灰白色、黑色、绿色、无色、黄色等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度（不透明、半透明、透明等）和粘度等。

据细菌菌落表面特征不同，可将菌落分为3型：

光滑型菌落（S型菌落）：菌落表面光滑、湿润、边缘整齐，新分离的细菌大多呈光滑型菌落。

粗糙型菌落（R型菌落）：菌落表面粗糙、干燥、呈皱纹或颗粒状，边缘大多不整齐。R型菌落多为S型细菌变异失去菌体表面多糖或蛋白质形成。R型细菌抗原不完整，毒力和抗吞噬能力都比S型细菌弱。但也有少数细菌新分离的毒力株就是R型，如炭疽孢杆菌、结核分枝菌等。

粘液型菌落（M型菌落）：菌落粘稠、有光泽、似水珠样。多见于厚荚膜或丰富粘液层的细菌、结核杆菌等。

②菌落溶血特征

α溶血：又称草绿色溶血，菌落周围培养基出现1~2mm的草绿色环，为高铁血红蛋白所致；

β溶血：又称完全溶血，菌落周围形成一个完全清晰透明的溶血环，是细菌产生的溶血素使红细胞完全溶解所致；

γ溶血：即不溶血，菌落周围的培养基没有变化，红细胞没有溶解或缺损。

③色素

有些细菌产生水溶性色素，使菌落和周围的培养基出现绿色、金黄色、白色、橙色、柠檬色等颜色，产生的色素有水溶性或脂溶性。

④气味

某些细菌在培养基中生长繁殖后可产生特殊气味，如铜绿假单胞菌（生姜气味）、变形杆菌（巧克力烧焦的臭味）、厌氧梭菌（腐败的恶臭味）、白色假丝酵母菌（酵母味）和放线菌（泥土

味）等。

（2）液体培养基

细菌在液体培养基中有3种生长现象：大多数细菌在液体培养基生长繁殖后呈均匀混浊；少数链状排列的细菌如链球菌、炭疽芽胞杆菌等则呈沉淀生长；枯草芽胞杆菌、结核分枝杆菌和铜绿假单胞菌等专性需氧菌一般呈表面生长，常形成菌膜。

（3）半固体培养基

半固体培养基主要用于细菌动力试验，有鞭毛的细菌除了沿穿刺线生长外，在穿刺线两侧也可见羽毛状或云雾状混浊生长。无鞭毛的细菌只能沿穿刺线呈明显的线状生长，穿刺线两边的培养基仍然澄清透明，为动力试验阴性。

5．分离细菌所要满足的培养条件

（1）适宜的培养基条件；

（2）适宜的温度条件；

（3）适宜的气体条件。

三、细菌的分离方法

细菌分离就是把病料中的病原菌或把目的菌从微生物的混合材料中分离培养出来，并获得目的菌的单一生长材料，从而进行诊断及有关研究工作。

1．待检材料的处理

无菌采集的病料不经处理可直接用于分离；污染较严重的病料，接种前必须处理后方可进行分离培养。

（1）加热处理法

当怀疑病原菌为芽胞菌时，可加入5-10倍灭菌生理盐水研磨(液体病料除外)，75℃水浴30min(或80℃ 15-20min)，可杀死细菌繁殖体(包括杂菌及病原菌)；然后将处理过的病料接种到适当的培养基上。

（2）接种易感动物

把病料接种易感动物，待其发病死亡后，取其血液或组织器官，接种到培养基上。利用此方法不但可以从污染的材料中分离出病原菌，而且还可以确定病原菌的毒力。

（3）化学药品处理