杆状病毒表达系统及其应用进展

综述与专论

生物技术通报

BI OTEC HNOLOG Y BULLETI N

2010年第10期

杆状病毒表达系统及其应用进展

韦永龙 李轶女 张志芳 沈桂芳

(中国农业科学院生物技术研究所,北京100081)

摘 要: 杆状病毒是节肢动物门的专性寄生病毒,20世纪80年代被开发为表达载体以来,由于其真核表达环境等优点,受到了广泛的重视和研究,短短不到30年的时间里,杆状病毒表达体系的重组载体构建技术,筛选技术得到了很大程度的改进和简化,成为与大肠杆菌、酵母、哺乳动物相并列的四大表达体系之一。在表面展示,类病毒颗粒表达,哺乳动物基因转移,RNA 干扰等方面取得了重要的成果。就杆状病毒表达系统的发展及其应用作一个综述。

关键词: 杆状病毒 BEVS 表达

Advances i n Research and Application of Bacul ovirus Expression Syste m

W ei Y onglong L i Y i nv Zhang Zhifang Shen G uifa ng

(B i o tec hnology Research Instit ute ,CAAS,B eijin g 100081)

Abstrac:t Bacu l ov iruses are ob li g ate l e t ha l pathogens o f arthropodas .They have been h i gh l y va l ued and w ide l y stud ied si nce be

i ng explo ited as a expression vector i n 1980s ,for t he ir exce llen t advantag e i nclud i ng eukaryotic express i on env iroment .In l ess t han 30years ,g reat advances have ach i eved i nvolv i ng reco m b i nant baculovirus constructi on and sc reeni ng .T hus ,t he bacul ov irus expressi on vec tor syste m (BEV S)has beco m e one o f the f our m ost popular expression syste m co m prisi ng bacte ri um ,yeasts ,m a mma li an ce lls and bacu loviruses .T he BEV S has been used i n surface d isplay ,v irus li ke particles producti on ,m a mm a lian ce lls gene de livery ,RNA i nterfe r ence ,etc .The deve l op m ent and applica tion o f the BEV S i s reviewed i n this arti c l e .

K ey words : Bacu l ov irus BEVS Express i on

收稿日期:2010 04 26

基金项目:国家自然科学基金项目(30770279),国家!863∀计划项目(2006AA10A119)作者简介:韦永龙,硕士,研究方向:分子病毒学;E ma i :l w ei yonglong @126 com 通讯作者:沈桂芳,教授,E m ai:l gf sh2008@caas net c n

杆状病毒是一种DNA 双链病毒,基因组约

80-160kb 之间。杆状病毒是节肢动物门的专性寄生病毒,目前已报道有600种以上的昆虫被杆状病毒所感染,包括鳞翅目、膜翅目、双翅目等7个目[1]

。根据包涵体的形态和病毒诱导的细胞病理学特征,杆状病毒分为核多角体病毒属(nucleopolyhedr ovirus ,NP V )

和颗粒体病毒属(g r anulov ir us ,GV )[2]

。杆状病毒表达系统(baculov ir us e xpression vector syste m,BE VS )是一个利用杆状病毒作为载体,在昆虫培养细胞或虫体中表达外源蛋白的真核表达系统。具有安全性高,真核修饰环境,容量大,表达量高等特点,自Sm it h GE 等于1983年利用A c NPV 成功表达外源蛋白以来,经过不到30年的发展,杆状病毒表达系统已经成为当今基因工

程四大表达系统(杆状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳动物

细胞表达系统)之一。

杆状病毒基因组较大,不易通过常规酶切连接载入外源基因,所以通常是将外源基因连接到转移载体上,此类转移载体含有病毒的两个同源臂,一个或多个杆状病毒启动子,将外源目的基因插入到启动子下游之后,与杆状病毒重组,获得重组病毒,将重组病毒纯化,感染昆虫细胞或虫体,外源基因随着病毒的复制的而获得表达。

1 重组杆状病毒的构建和纯化

最早的重组病毒构建使用的是野生病毒,当病毒与转移载体发生重组之后,病毒的多角体蛋白基因受到破坏,不能形成多角体,感染这种重组毒株的

生物技术通报B iotechnology Bulletin2010年第10期

细胞在显微镜下形成空斑,通过多次重复筛选,可以对重组病毒进行纯化,但此过程费时费力,效率很低,是杆状病毒应用中一个重要的限制因素。因此,近年来开发了多种技术,大大优化了杆状病毒的构建和筛选过程。

1.1 杆状病毒的线性化

1990年,K itts等[3]在Ac MNP V的多角体蛋白基因所在(po lyhedri n)位置引入一个惟一的限制性酶切位点(B su36I),使亲本病毒线性化,降低了野生型病毒背景,使重组病毒的比率达到了25%以上,提高了重组病毒的筛选效率,随后在杆状病毒DNA中的必需基因orf1629外再加入一个B s u36I 位点,B s u36I酶切后orf1629失活,只能通过与携带外源基因的转移载体重组,补齐这一个病毒结构基因后方可复制,使重组率提高到了90%[4]。1998年,吴祥甫[5]也在B mNPV中引入了B s u36I,构建了B mNP V的线性化重组系统。理论上,线性化病毒重组的重组率能达到100%,但实际操作中,仍然存在很大比率的假阳性。

1.2 体外重组表达载体(C re loxP系统)

利用传统的体内同源重组获得重组病毒,效率很低,为了解决这一问题,1992年Per km an等[6]根据噬菌体p1编码的C re重组酶能够催化特异位点lox发生酶促交换反应的原理,分别在杆状病毒体多角体基因以及重组载体上引入了l o xP位点。重组时,先将载体酶切,线性化,然后与修饰过的杆状病毒及C re 酶液混合,37#下温育约20m i n,再转染昆虫细胞,借助空斑及载体携带的 半乳糖甘酶活性,很容易筛选得到重组病毒。改进反应的条件和反应物的比率,尽管重组比率仍然不高,却能得到绝对数量较多的重组病毒,所以此方法特别适于高通量表达真核生物的c DNA文库,该系统的缺点是会产生多轮重组而导致几个载体同时串联加载到杆状病毒上。

1.3 酵母 昆虫细胞穿梭质粒载体

Patel等构建了酵母-昆虫细胞穿梭质粒载体,他们将啤酒酵母的自主复制序列(autono m ously rep licating sequence,ARS)和有丝分裂着丝点功能相关序列(centro m eric sequence,CNE)引入杆状病毒基因组的多角体基因上,使杆状病毒能够在酵母体内进行复制,并能够和相应的转移载体发生重组。详细步骤:在A c MNPV多角体蛋白基因中分别插入SUP4 0,ARS,URA3及CE N序列,其中URA3和SUP4 0为筛选标记。转移载体中外源基因的两翼分别为病毒序列,酵母ARS序列。在酵母细胞内,病毒DNA与转移载体重组后,能够删除SUP4 0基因。由于缺少SUP4 0的酵母对刀豆氨酸(C anava n i n e)显示抗性,所以用含有刀豆氨酸的选择培养基,即可筛选发生重组的酵母菌落,提取重组菌株的总DNA,利用蔗糖密度梯度离心纯化杆状病毒DNA,转染昆虫细胞,即得到表达外源蛋白的重组病毒。此方法最快可以在10d内得到重组病毒,而且免除了烦琐的空斑筛选,另外,此方法还能同时分离几个不同的重组子,所以是一个快速而高效的重组筛选系统。其缺点是需要利用蔗糖密度梯度超速离心来分离重组的DNA,否则转染重复性不好。

1.4 大肠杆菌 昆虫细胞穿梭质粒载体系统(Bac to

B ac系统)

1993年,Lucko w等[7]根据F因子载体的原理,在杆状病毒基因组中引入了一个细菌复制子,构建了一种新型杆状病毒穿梭载体,取bacu lov irus的字头和p las m id的字尾命名为bac m i d,此质粒既能在大肠杆菌中复制,也能感染昆虫细胞。Bac m i d中,在多角体蛋白基因所位置加上att T n7位点,卡那霉素抗性基因,以及作为筛选标记的LacZ基因,在大肠杆菌中,利用辅助质粒携带的Tn7转座酶,bac m i d 就能够与携带外源基因的转移载体发生特异位点重组,通过转移载体携带的抗性基因,病毒发生重组后破坏了Lac Z基因而使其所在的细菌宿主不能形成蓝斑,能够高效筛选出含有重组病毒细菌单克隆。此法与传统方法相比,操作简单,耗时短,整个重组病毒筛选过程都能够在细菌中完成,所以周期可以缩短至7-10d,而且不易出现假阳性,因此是一个便捷的系统。

值得一提的是,利用侵染性的二氨基庚二酸(DAP)营养缺陷型的大肠杆菌作为bac m i d的宿主,携带重组bac m i d的细菌,能够在耶尔森氏鼠疫杆菌(Yersinia p seudotuberco l u sis)的辅助下,侵染Sf9细胞,由于昆虫细胞及细胞培养基中缺少DAP,细菌在Sf9细胞内裂解,释放病毒DNA,从而感染细胞[8]。此过程省去了提取bac m i d和转染步骤,更经

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