杆状病毒表达系统及其应用进展

合集下载
  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。

综述与专论
生物技术通报
BI OTEC HNOLOG Y BULLETI N
2010年第10期
杆状病毒表达系统及其应用进展
韦永龙 李轶女 张志芳 沈桂芳
(中国农业科学院生物技术研究所,北京100081)
摘 要: 杆状病毒是节肢动物门的专性寄生病毒,20世纪80年代被开发为表达载体以来,由于其真核表达环境等优点,受到了广泛的重视和研究,短短不到30年的时间里,杆状病毒表达体系的重组载体构建技术,筛选技术得到了很大程度的改进和简化,成为与大肠杆菌、酵母、哺乳动物相并列的四大表达体系之一。

在表面展示,类病毒颗粒表达,哺乳动物基因转移,RNA 干扰等方面取得了重要的成果。

就杆状病毒表达系统的发展及其应用作一个综述。

关键词: 杆状病毒 BEVS 表达
Advances i n Research and Application of Bacul ovirus Expression Syste m
W ei Y onglong L i Y i nv Zhang Zhifang Shen G uifa ng
(B i o tec hnology Research Instit ute ,CAAS,B eijin g 100081)
Abstrac:t Bacu l ov iruses are ob li g ate l e t ha l pathogens o f arthropodas .They have been h i gh l y va l ued and w ide l y stud ied si nce be
i ng explo ited as a expression vector i n 1980s ,for t he ir exce llen t advantag e i nclud i ng eukaryotic express i on env iroment .In l ess t han 30years ,g reat advances have ach i eved i nvolv i ng reco m b i nant baculovirus constructi on and sc reeni ng .T hus ,t he bacul ov irus expressi on vec tor syste m (BEV S)has beco m e one o f the f our m ost popular expression syste m co m prisi ng bacte ri um ,yeasts ,m a mma li an ce lls and bacu loviruses .T he BEV S has been used i n surface d isplay ,v irus li ke particles producti on ,m a mm a lian ce lls gene de livery ,RNA i nterfe r ence ,etc .The deve l op m ent and applica tion o f the BEV S i s reviewed i n this arti c l e .
K ey words : Bacu l ov irus BEVS Express i on
收稿日期:2010 04 26
基金项目:国家自然科学基金项目(30770279),国家!863∀计划项目(2006AA10A119)作者简介:韦永龙,硕士,研究方向:分子病毒学;E ma i :l w ei yonglong @126 com 通讯作者:沈桂芳,教授,E m ai:l gf sh2008@caas net c n
杆状病毒是一种DNA 双链病毒,基因组约
80-160kb 之间。

杆状病毒是节肢动物门的专性寄生病毒,目前已报道有600种以上的昆虫被杆状病毒所感染,包括鳞翅目、膜翅目、双翅目等7个目[1]。

根据包涵体的形态和病毒诱导的细胞病理学特征,杆状病毒分为核多角体病毒属(nucleopolyhedr ovirus ,NP V )
和颗粒体病毒属(g r anulov ir us ,GV )[2]。

杆状病毒表达系统(baculov ir us e xpression vector syste m,BE VS )是一个利用杆状病毒作为载体,在昆虫培养细胞或虫体中表达外源蛋白的真核表达系统。

具有安全性高,真核修饰环境,容量大,表达量高等特点,自Sm it h GE 等于1983年利用A c NPV 成功表达外源蛋白以来,经过不到30年的发展,杆状病毒表达系统已经成为当今基因工
程四大表达系统(杆状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳动物
细胞表达系统)之一。

杆状病毒基因组较大,不易通过常规酶切连接载入外源基因,所以通常是将外源基因连接到转移载体上,此类转移载体含有病毒的两个同源臂,一个或多个杆状病毒启动子,将外源目的基因插入到启动子下游之后,与杆状病毒重组,获得重组病毒,将重组病毒纯化,感染昆虫细胞或虫体,外源基因随着病毒的复制的而获得表达。

1 重组杆状病毒的构建和纯化
最早的重组病毒构建使用的是野生病毒,当病毒与转移载体发生重组之后,病毒的多角体蛋白基因受到破坏,不能形成多角体,感染这种重组毒株的
生物技术通报B iotechnology Bulletin2010年第10期
细胞在显微镜下形成空斑,通过多次重复筛选,可以对重组病毒进行纯化,但此过程费时费力,效率很低,是杆状病毒应用中一个重要的限制因素。

因此,近年来开发了多种技术,大大优化了杆状病毒的构建和筛选过程。

1.1 杆状病毒的线性化
1990年,K itts等[3]在Ac MNP V的多角体蛋白基因所在(po lyhedri n)位置引入一个惟一的限制性酶切位点(B su36I),使亲本病毒线性化,降低了野生型病毒背景,使重组病毒的比率达到了25%以上,提高了重组病毒的筛选效率,随后在杆状病毒DNA中的必需基因orf1629外再加入一个B s u36I 位点,B s u36I酶切后orf1629失活,只能通过与携带外源基因的转移载体重组,补齐这一个病毒结构基因后方可复制,使重组率提高到了90%[4]。

1998年,吴祥甫[5]也在B mNPV中引入了B s u36I,构建了B mNP V的线性化重组系统。

理论上,线性化病毒重组的重组率能达到100%,但实际操作中,仍然存在很大比率的假阳性。

1.2 体外重组表达载体(C re loxP系统)
利用传统的体内同源重组获得重组病毒,效率很低,为了解决这一问题,1992年Per km an等[6]根据噬菌体p1编码的C re重组酶能够催化特异位点lox发生酶促交换反应的原理,分别在杆状病毒体多角体基因以及重组载体上引入了l o xP位点。

重组时,先将载体酶切,线性化,然后与修饰过的杆状病毒及C re 酶液混合,37#下温育约20m i n,再转染昆虫细胞,借助空斑及载体携带的 半乳糖甘酶活性,很容易筛选得到重组病毒。

改进反应的条件和反应物的比率,尽管重组比率仍然不高,却能得到绝对数量较多的重组病毒,所以此方法特别适于高通量表达真核生物的c DNA文库,该系统的缺点是会产生多轮重组而导致几个载体同时串联加载到杆状病毒上。

1.3 酵母 昆虫细胞穿梭质粒载体
Patel等构建了酵母-昆虫细胞穿梭质粒载体,他们将啤酒酵母的自主复制序列(autono m ously rep licating sequence,ARS)和有丝分裂着丝点功能相关序列(centro m eric sequence,CNE)引入杆状病毒基因组的多角体基因上,使杆状病毒能够在酵母体内进行复制,并能够和相应的转移载体发生重组。

详细步骤:在A c MNPV多角体蛋白基因中分别插入SUP4 0,ARS,URA3及CE N序列,其中URA3和SUP4 0为筛选标记。

转移载体中外源基因的两翼分别为病毒序列,酵母ARS序列。

在酵母细胞内,病毒DNA与转移载体重组后,能够删除SUP4 0基因。

由于缺少SUP4 0的酵母对刀豆氨酸(C anava n i n e)显示抗性,所以用含有刀豆氨酸的选择培养基,即可筛选发生重组的酵母菌落,提取重组菌株的总DNA,利用蔗糖密度梯度离心纯化杆状病毒DNA,转染昆虫细胞,即得到表达外源蛋白的重组病毒。

此方法最快可以在10d内得到重组病毒,而且免除了烦琐的空斑筛选,另外,此方法还能同时分离几个不同的重组子,所以是一个快速而高效的重组筛选系统。

其缺点是需要利用蔗糖密度梯度超速离心来分离重组的DNA,否则转染重复性不好。

1.4 大肠杆菌 昆虫细胞穿梭质粒载体系统(Bac to
B ac系统)
1993年,Lucko w等[7]根据F因子载体的原理,在杆状病毒基因组中引入了一个细菌复制子,构建了一种新型杆状病毒穿梭载体,取bacu lov irus的字头和p las m id的字尾命名为bac m i d,此质粒既能在大肠杆菌中复制,也能感染昆虫细胞。

Bac m i d中,在多角体蛋白基因所位置加上att T n7位点,卡那霉素抗性基因,以及作为筛选标记的LacZ基因,在大肠杆菌中,利用辅助质粒携带的Tn7转座酶,bac m i d 就能够与携带外源基因的转移载体发生特异位点重组,通过转移载体携带的抗性基因,病毒发生重组后破坏了Lac Z基因而使其所在的细菌宿主不能形成蓝斑,能够高效筛选出含有重组病毒细菌单克隆。

此法与传统方法相比,操作简单,耗时短,整个重组病毒筛选过程都能够在细菌中完成,所以周期可以缩短至7-10d,而且不易出现假阳性,因此是一个便捷的系统。

值得一提的是,利用侵染性的二氨基庚二酸(DAP)营养缺陷型的大肠杆菌作为bac m i d的宿主,携带重组bac m i d的细菌,能够在耶尔森氏鼠疫杆菌(Yersinia p seudotuberco l u sis)的辅助下,侵染Sf9细胞,由于昆虫细胞及细胞培养基中缺少DAP,细菌在Sf9细胞内裂解,释放病毒DNA,从而感染细胞[8]。

此过程省去了提取bac m i d和转染步骤,更经
2
2010年第10期韦永龙等:杆状病毒表达系统及其应用进展
济、高效。

1.5 杆状病毒 S2系统
2000年,Lee等[9]构建了杆状病毒 S2系统,与其他的系统不同,该系统的反应器是果蝇的S2细胞。

此系统中,杆状病毒的多角体基因启动子被果蝇的热激蛋白70基因(hsp70)、肌动蛋白5c基因(acti n5c)和金属硫蛋白基因等启动子代替,和转移载体重组后,它们能驱动外源基因的高水平表达。

表达的细胞比率高,几乎全部感染重组杆状病毒的细胞都出现表达。

其表达量远远高于其它的真核载体系统。

另外,该系统的最大优点是,病毒感染及表达外源蛋白并不引起细胞的裂解,因此,它是一个非常优越的杆状病毒表达系统。

1.6 Gate w ay技术
Gate w ay克隆系统是美国Inv itrogen公司开发的一项新颖的克隆表达系统,该系统利用 噬菌体位点特异重组的原理,进行酶促反应而得到所需要的重组病毒,其核心是两次重组反应:BP(att B∃att P)和LR(att L∃att R)。

通过第一个反应,可以将外源基因片段(含有attB)整合到供体质粒(donor vector,含有attP)上,得到入门载体(entry clone,含有att L)上,第二个反应将入门载体上的外源基因转移到目的载体(desti n ation vector,含有att R)上,得到表达载体(expressi o n clone)[10]。

反应的过程是将att R位点引入杆状病毒基因组上并线性化得到得到Bacu l o D irect T M线性DNA,经改造过的杆状病毒基因组在体外含有Gate way TM LR C l o nase T M酶的反应体系中,就能够与携带外源基因的入门克隆载体进行重组。

反应在室温条件下反应1h即可完成,反应混和物可以直接用于转染昆虫细胞,因此,和Aslan i d i s 等[11]在1990年开发,而后被利用于重组杆状病毒构建的T4连接酶依赖克隆法相比,省去了在细菌中完成修复缺口的步骤,转染细胞到杆状病毒的分离,大约8h即可完成,是目前最快的系统。

该系统还有重组效率高,表达不受限制性酶切位点限制等特点,因此,此系统是目前最具应用潜力的一个杆状病毒重组体系。

2 杆状病毒的应用
杆状病毒表达系统相对于其他的表达系统具有以下几个优点:(1)真核表达环境,表达产物有适当的翻译后修饰;(2)杆状病毒基因组较大,可以插入大片段或同时表达多个外源基因;(3)安全性高,重组杆状病毒由于其多角体蛋白基因受到破坏,在自然环境中不能感染昆虫,在人体细胞中不能复制;
(4)杆状病毒具有多角体启动子及P10等晚期强启动子,外源蛋白表达量很高,晚期启动子能够用来表达一些对细胞有毒害作用的蛋白[12]。

鉴于这些优点,除了常规的蛋白表达之外,杆状病毒在以下几个方面得到了广泛的应用。

2.1 杆状病毒作为表面展示系统及其应用
1995年,Boubli k等[13]首次将标记基因谷胱甘肽 S 转移酶(g lutath i o ne S transferase,GST)基因以及艾滋病病毒的表面糖蛋白gp120与苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(A c MNPV)的gp64蛋白基因融合,表达之后,在A c MNPV囊膜表面出现了有功能的融合蛋白,开创了杆状病毒表面展示的先例。

此后,鉴于杆状病毒翻译后修饰等优点,多种大分子的复杂真核蛋白已经在杆状病毒表面展示系统表达展示,在展示病毒蛋白方面,此系统也得到了广泛的应用。

近年来,杆状病毒表面展示系统在单克隆抗体的制备、新型疫苗研制等领域取得了很大的成就。

在单抗研制方面,和其他的表面展示系统一样,在杆状病毒的颗粒表面展示病原体的抗原蛋白,后用重组病毒颗粒作为抗原免疫动物,激活一系列淋巴细胞之后,分离B淋巴细胞,与骨髓瘤细胞融合,用重组病毒颗粒来筛选表达高特异性抗体的融合细胞,再扩大培养,得到单克隆抗体。

这种方法与传统的制备单抗相比,不用纯化抗原就能直接免疫动物,省去了大量的时间和人力。

早在1992年,R eed 等[14]就利用杆状病毒表达了人类的B淋巴瘤细胞的膜蛋白Bc l 2,然后用此重组病毒免疫小鼠,最终筛选了两株表达特异单克隆抗体的杂交瘤细胞。

而L i n dley等[15]将人肝细胞核受体(LXR )和类法尼醇X受体(FXR)与杆状病毒的囊膜病毒gp64中融合表达,免疫小鼠获得了特异性的人源LXR 和FXR 的高亲和力单克隆抗体。

Sa itoh等[16]利用gp64的转基因小鼠作为免疫对象,与BALB/c小鼠相比,发现这些小鼠对杆状病毒的应答较弱,有利于筛选针对展示蛋白的特异抗体,利用此转基因小鼠,他们得到了多肽转运蛋白PepT1的47种单克隆抗体。


3
生物技术通报B iotechnology Bulletin2010年第10期
化因子受体CCR2的7种单克隆抗体。

在新型疫苗的研制方面,将外源蛋白与杆状病毒的囊膜蛋白相融合,表达的外源蛋白展示于病毒粒子表面,能够直接作为疫苗诱导动物产生保护性免疫。

Rahm an等[17]将小反刍兽疫病毒(PPRV)的胞膜糖蛋白及牛瘟病毒的血凝素蛋白与家蚕核型多角体病毒的gp64蛋白融合,表达之后,用重组的病毒粒子免疫小鼠,能够诱导小鼠针对PPRV或RPV 的免疫应答。

而Feng等[18]将引起严重急性呼吸综合征(S ARS)的冠状病毒的刺突蛋白(Spike)的基因与gp64想融合,展示在病毒表面的刺突蛋白能够在小鼠体内诱导针对Sp i k e蛋白的中和性抗体。

T a m i 等[19]将口蹄疫病毒F MDV的位点A抗原与gp64融合表达后发现,重组的杆状病毒能够保护小鼠抵御F MDV的袭击。

Lu等[20]禽流感H5N1的血凝素蛋白展示于病毒表面并将其免疫小鼠,发现能够刺激小鼠产生针对试验毒株的中和性抗体。

Xu等[21]将猪瘟病毒(CSF V)的E2糖蛋白与gp64蛋白融合之后,将其免疫小鼠,发现能够诱导小鼠产生很高的针对E2的中和性抗体。

这些试验结果均表明,杆状病毒表面展示系统是一个很有应用前景的基因工程疫苗表达系统。

2.2 杆状病毒用于表达类病毒颗粒
类病毒颗粒指无核酸而仅由病毒蛋白组成的类似病毒形状的空壳病毒。

利用这些类病毒颗粒对于病毒蛋白组装的研究,病毒疫苗的研制,以及作为基因转移载体的潜在价值都受到了人们的广泛重视[22,23]。

类病毒颗粒既可以通过多个携带单一病毒结构蛋白的杆状病毒共转染昆虫细胞获得,也可以通过一个携带多个病毒结构蛋白的杆状病毒转染昆虫细胞获得。

目前,已有包括艾滋病病毒、疱疹病毒、人类乳头状瘤病毒、多瘤病毒、细小病毒、传染性法氏囊病毒、丙型肝炎病毒、肠病毒和急性呼吸系统综合症病毒等通过杆状表达体系成功表达[12]。

这些病毒由于其结构完整,最大限度地保留了病毒蛋白的免疫决定簇,因此,在疫苗的研制中显示了其优势,猪圆环病毒(PC V)是目前发现的哺乳动物中最小的DNA病毒,其核衣壳蛋白在昆虫中表达后能够折叠成类病毒颗粒,这些颗粒能够保护猪免受PC V的侵袭[24,25]。

勃林格殷格翰动物保健公司(C ircoFlex )和英特威/先灵葆雅动物保健公司(C ircu m vent )已经将其开发,并已经在市场上大量推广[26]。

一些病毒,包括人类乳头状瘤病毒(H PV),丙型肝炎病毒(HCV),暂时不能在体外细胞培养体系中复制,这在一定程度上制约了其研究。

利用杆状病毒表达系统,能够在昆虫体内合成HPV和H C V 的类病毒颗粒[27,28],这些颗粒不仅有助于我们对病毒的蛋白结构,蛋白组装过程,细胞吸附和侵染过程进行研究。

而且,这些颗粒也是安全,免疫原性高的疫苗,能够诱导很强的细胞免疫及体液免疫[29 31]。

另外,杆状病毒生产类病毒颗粒技术还可以用来构建重组腺病毒相关病毒(r AAV)载体,用于基因治疗[32]。

2.3 杆状病毒用于哺乳动物的基因转移载体
早在1983年,就发现了杆状病毒能够被包括哺乳动物细胞在内的非靶细胞摄取,但不能在这些细胞中复制,另外,Carbonell[33 35]发现,在劳斯氏肉瘤病毒(RSV)启动子的帮助下,杆状病毒能够在哺乳动物中表达外源基因。

这为利用杆状病毒作为基因转移载体奠定了理论基础。

随后,H o f m ann和Boy ce[36,37]分别用荧光素酶基因和 半乳糖苷酶基因作为报告基因,在人类肝脏细胞中实现了表达,杆状病毒作为外源基因转移载体逐渐受到重视。

利用杆状病毒作为基因转移载体,杆状病毒不整合到基因组上,也不能够复制,所以安全性高。

2000年,A irenn 等[38]利用杆状病毒携带作为基因转移载体,在兔颈动脉表达了 半乳糖苷酶,成功实现了杆状病毒携带外源基因在哺乳动物体内的表达。

随后,W ang 等[39]发现携带白喉毒素基因的杆状病毒能够抑制在体内外抑制神经胶质瘤细胞的生长。

K i m等[40]发现,携带作为肿瘤抗原的端粒逆转录酶的杆状病毒,能够抑制小鼠神经胶质瘤的生长。

另外,携带EB的Rta蛋白基因的杆状病毒还能够诱导潜伏的EB病毒进入复制裂解周期,并抑制细胞生长,从而能够抑制EB细胞引起的肿瘤[41]。

杆状病毒作为基因治疗的载体虽然取得了一定的成就,但是,由于杆状病毒不能复制,其在哺乳动物中的表达持续时间较短,因此转化所需的病毒量大,疗效有限,目前还未有利用杆状病毒作为临床基因治疗的报道。

但是,杆状病毒具有广泛的哺乳动物受纳细胞,是研究某些基因及蛋白功能的良好载
4
2010年第10期韦永龙等:杆状病毒表达系统及其应用进展
体,具有重要的生物学及医学价值。

为了研究单纯疱疹病毒U(L)34蛋白的功能,Y e[42]将此蛋白构建到杆状病毒载体上,再将重组的杆状转染细胞,能够确定该蛋白在细胞核膜上的定位,并发现了该蛋白引起的核膜结构变化。

而Delaney则将整个乙肝基因组整合到杆状病毒上,然后转化人H epG2细胞,发现乙肝蛋白在该细胞中能够稳定表达,而乙肝病毒也能够顺利复制,为研究乙肝的复制特点及病理机制提供了一个很好的研究模型。

Delaney[43,44]发现,核苷类抗病毒药物拉米夫定(beta 2%,3% d i d eoxy 3% th i a cy ti d i n e)能够抑制乙肝病毒在H epG2细胞中的复制,从而为下一步研究药物及细胞因子对乙肝的抑制及治疗作用奠定了基础。

Pfoh l等[45]则利用杆状病毒在哺乳动物细胞中成功表达了KATP离子通道,并对其进行了功能研究。

Am es[46,47]利用重组杆状病毒在人体细胞中表达G蛋白偶联受体,并对其进行功能和对药物的应答研究,取得了较好的试验结果。

因此,杆状病毒作为一种瞬时表达的基因转移载体,能够短时间内获得高表达,而且对于表达一些结构复杂的多亚基蛋白,以及同时表达多个基因,甚至完全携带整个病毒基因组,都体现了其他基因转移载体难以比拟的优势。

2.4 杆状病毒与RNA干扰
除了表达蛋白,杆状病毒也可以作为携带ShR NA表达盒的载体,对靶细胞进行RNA i基因干扰研究。

利用杆状病毒对哺乳动物进行RNA i干扰,与用脂质体包裹质粒转化相比,其转化效率高,而与使用逆转录病毒及腺病毒相比,不需要辅助病毒协助重组病毒的包装,因此操作更方便。

N icholson等[48]将核纤层蛋白的ShRNA导入到人体细胞中,能够观察到对应的mRNA发生显著减少。

Lu等[49]构建了携带猪蓝耳病ShRNA的杆状病毒,发现其能够显著抑制猪蓝耳病病毒在细胞中的复制,为杆状病毒作为小RNA转移载体用于抗病毒研究提供了基础。

Suzuki等[50]将丙肝病毒的一段保守的核心区域构建到杆状病毒上,并用此载体转化带有H C V基因组全长全长复制子的细胞NNC#2,发现重组病毒能够明显抑制H C V核心蛋白的在NNC#2中的表达。

S tar key等[51]诱导H epG2细胞中整合于杆状病毒的乙肝病毒进行复制,延续培养10d,大量病毒复制,细胞进入慢性乙肝感染阶段。

如果在诱导之前,预先导入携带ShRNA表达盒的杆状病毒,能够明显减少共价,闭合,环状乙肝DNA(CCCDNA)的含量。

而如果在慢性感染期间导入携带ShRNA表达盒的杆状病毒,乙肝表面抗原(H Bs Ag),RNA及DNA也明显减少。

Suzuki[52]发现,携带ShRNA表达盒的杆状病毒还能显著抑制细胞内禽流感病毒的复制。

这些研究成果为进一步研究和开发杆状病毒作为抗病毒工具提供了参考。

3 杆状病毒表达载体的不足和展望
尽管杆状病毒有着一系列的优点,也存在不足。

首先,蛋白翻译后修饰简单,不能满足真核蛋白表达的要求。

一般来说,昆虫细胞中杆状病毒系统表达的外源糖蛋白,糖链短,种类单一,有的还会额外加上岩藻糖,另外,N 糖苷链末端没有被唾液酸化,这样的蛋白稳定性较差,严重影响其应用价值。

对此, H ollister[53]将带有牛 1,4半乳糖苷转移酶表达盒的质粒导入Sf9细胞中,构建了能够对病毒表达蛋白进行 1,4半乳糖苷修饰的转基因细胞。

Au m ill er等[54]开发了一种命名为SfS WT 1的细胞,表达5种哺乳动物糖基转移酶和两种唾液酸合成酶,杆状病毒在这种细胞中所表达的蛋白能够被唾液酸化。

其次,杆状病毒所用的启动子多为多角体启动子,多角体启动子为晚期表达启动子,表达量高,所以能够短时间内产生大量的蛋白,有些蛋白来不及正确折叠而形成不溶性蛋白颗粒,另外,晚期启动子启动表达落后于几丁质酶、胱氨酸蛋白酶等基因的表达。

Ohka wa等[55]在1994年最早报这些酶能够加速昆虫的死亡和溃烂,从溃烂的虫体中分离蛋白的难度比新鲜虫体的高。

K aba等[56]发现,删除杆状病毒基因组的几丁质酶和组织蛋白酶能够减少其所表达的外源蛋白的降解。

共表达各种分子伴侣,能够帮助表达蛋白的折叠,增加蛋白的表达量和可溶蛋白的比率[57 60]。

H itchm an等[61]发现,删除Ac MNP V 基因组中的p26,p10和p74三个基因,能够增加其所携带的外源蛋白基因的表达量。

总之,杆状病毒表达系统还在不断地改进和优化。

随着杆状病毒及其宿主的分子生物学研究的不断加深,影响杆状病毒表达的基因调控及环境因素将会进一步阐明,杆状病毒将不仅在其操作上更方
5
生物技术通报B iotechnology Bulletin2010年第10期
便,更高效,外源蛋白的表达量,表达蛋白的修饰,可溶性,生物活性等都将会得到提高。

从而能够适应生物学,医学,农业等不同领域不同蛋白的表达要求,在更大程度上为人类造福。

参考文献
[1]吕鸿声.昆虫病毒分子生物学[M].北京:中国农业科技出版
社,1998.
[2]van RegenmortelMHV,FauquetC,B i shop D,et a.l V i ru s taxono m y:
class ificati on and n o m encl ature of viruses:seven t h report of t h e Inter national Co mm i ttee on Taxono m y of V iruses.San D i ego:A cade m i c Press,2000.
[3]K itts PA,Ayres M D,Possee RD.Li n eari zation of b acu l ovirus DNA
enhances t he recovery of reco m b i nan t virus express i on vectors.Nu clei c A ci ds Res,1990,18(19):5667 5672.
[4]K itts PA,Possee RD.A m ethod f or produ ci ng reco m b i nant b acu l ovir
us exp res s i on vect ors at h i gh frequ ency.B i otechn iqu es,1993,14
(5):810 817.
[5]W u XF,Y ang GZ,H u J X.A reco m b i nan t rescue li nearizable BmNP V
baculov i rus Bm Bac PAK:Ch i na,98110963.2[P]1998.
[6]Peakm an TC,H arris RA,G e w ert DR.H igh l y effici en t generati on of
recomb i nan t baculoviruses by enz ym ati call y m ed icated s i te speci fi c in v itro reco m b i nation.NucleicA ci ds Res,1992,20(3):495 500.
[7]Lu cko w VA,Lee SC,B arry GF,O li ns PO.E ffici en t generati on of i n
f ecti ou s recomb i nan t bac u loviruses by s it e s pecific transpos on m ed i a
t ed i n s erti on of forei gn genes i nto a bacu l ovir u s gen o m e propagat ed
i n E sc h e richia coli.J V i ro,l1993,67(8):4566 4579.
[8]Yao LG,Sun J C,Xu H,et a.l A novel econo m ic m et hod for h i gh
t h roughput produ cti on of reco m b i nant bacu l ovirus by i n fecti ng i nsect cells w ith Bac m i d contai n i ng d i m i nop i m el ate auxotroph i c E sc h erichia coli cells.J B i otec hno,l2009,145(1):23-9.
[9]Lee DF,Ch en CC,H s u TA,Juang J L.A baculovirus s uperi n f ecti on
syste m:effici en t veh i cle for gene tran sfer i n to Drosophil a S2cell s.J V iro,l2000,74(24):11873 11880.
[10]H artley J L,Te m ple GF,B rasc h M A.DNA cl oni ng us i ng i n v it ro site
specific reco m bi n ati on.Geno m e Res,2000,10(11):1788 1795. [11]As l an i d is C,de J ong PJ.L i gati on i ndependent cl oni ng of PCR prod
uct s(LIC P CR).Nu clei c A cids Res,1990,18(20):6069 6074. [12]Hu YC.Bacu l ov i ru s as a h i gh l y effi cient exp ressi on vect or i n i nsect
and m a mm alian cells.Acta Phar macol S i n,2005,26(4):405 416.
[13]Boub lik Y,D i Bonito P,Jones I M.Eukaryotic virus d is p l ay:engi
neeri ng t he m aj or surf ace gl ycoprotei n of the Autograph a californica nuclear po l yhed rosis vi ru s(A c NPV)f or t h e p resen t ati on of forei gn protei n s on t he v i ru s surface.B i otechnol ogy(NY),1995,13(10):
1079 1084.
[14]Reed J C,T anaka S,C uddy M,et a.l A strategy for generati ng m ono
cl onal an ti bod i es agai n st recomb i nant b acu l ovirus p roduced p ro tei ns:appli cati on t o t h e B cl 2oncoprotei n.Ana l B i och e m,1992,
205(1):70 76.
[15]L i ndley KM,Su J L,H odges PK,et a.l Production ofmon oclonal an
tibod i es u si ng reco m b i nant baculovirus d i sp l ay i ng gp64 f us i on p ro tei ns.J ournal of I mm unol ogical M ethods,2000,234(1 2):
123 135.
[16]S ai toh R,Ohto m o T,Ya m ada Y,et a.l V iral envelope p rotei n gp64
tran s gen i c m ou s e facili tates t h e generation ofm on ocl onal an ti bodies aga i nst exogenous m e mb rane p rot e i ns d is p layed on bacu lovirus.J
I mm unolM ethods,2007,322(1 2):104 117.
[17]R ahmanMM,ShailaM S,Gop i nathan KP.Baculovirus display of f u
sion p rotei n of peste des petits ru m i nan ts virus and h e m aggluti na tion p rotei n of R i nderpest v i ru s and i m m unogen i city of t h e d is p layed p rot e i ns i n m ouse m ode.l V i rol ogy,2003,317(1):36 49. [18]Feng Q,L i u Y,Qu X,et a.l Baculov i rus s u rface display of SARS
coronavi ru s(SARS Co V)spike p rotei n and i m munogen icit y of the
d is p layed p rotei n i n m i c
e models.DNA C ell B i o,l2006,25(12):
668 673.
[19]Ta m i C,Peral ta A,Barb i eri R,et a.l I m m un ol og i cal prop erties of
F M DV gP64f us i on p rot e i ns expressed on SF9cell and baculovirus
s u rfaces.V accine,2004,23(6):840 845.
[20]Lu L,Yu L,Kw ang J.Baculovirus surface dis p layed he m agg l uti n i n
ofH5N1i n fl uen za v i ru s s u stai ns its au t h enti c cleavage,he m agg l uti nati on activit y,and an tigen ici ty.B ioch e m B i ophys Res C o mm un,
2007,358(2):404 409.
[21]Xu XG,L i u H J.B acu lovirus s u rf ace d is p lay of E2envelope glyco
p rotei n of cl assical s w i n e fever virus and i m m unogen i cit y of t h e
d is p layed protei n s i n a m ou s
e m ode.l Vacci n e,2008,26(43):
5455 5460.
[22]M aranga L,C ruz PE,Aun i ns J G,Carrondo M J.Production of core
and virus li ke particl es w ith bacu lovirus i n fect ed i nsect cell s.Adv
B i oche m Eng B iotechno,l2002,74:183 206.
[23]G arcea RL,G i ss m ann L.V irus like particl es as vacci nes and vessel s
for t h e deli very of s m allm ol ecules.Curr Op i n B i ot echno,l2004,15
(6):513 517.
[24]L i u L J,Su z uk iT,T s une m i tsu H,et a.l E ffi cient producti on of t ype2
porci ne circovirus li ke parti cles by a reco m b i nan t bac u lovirus.A rch V i ro,l2008,153(12):2291 2295.
[25]N a w ag i tgu l P,M orozov I,Boli n SR,et a.l Open readi ng fra m e2of
porci ne circovirus t ype2encodes am ajor capsid protei n.J Gen V ir o,l2000,81(Pt9):2281 2287.
[26]赵东升,刘有昌,李祥健.猪圆环病毒2型疫苗的应用现状及展
望.畜禽业,2008(11):42 43.
[27]V ol pers C,S chir m ach er P,S treeck RE,S app M.A sse m b l y of the
m ajor and t h em inor capsid protei n of hum an pap illo m avirus t ype33
i n to virus li k e p articl es and tubular struct u res in i n s ect cells.V irol
6。

相关文档
最新文档