脂肪干细胞的体外培养
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脂肪干细胞基础与临床
干细胞生物学特性
干细胞(Stem cell,SC):
− 干细胞(Stem cell,SC)是有自我复制、高度增殖和多向化潜能的细胞群 体,这些细胞以通过细胞分裂维持自身细胞的大小,同时又可以进一步分 成为各种不同的组织细胞,从构成机体各种复杂的组织器官。 干细胞技术: − 又称为再生医疗技术,是指通过对干细胞进行分离、体外培养、定向诱导、 甚至基因修饰等过程,在体外繁育出全新的、正常的甚至更年轻的细胞、 组织或器官,并最终通过细胞、组织或器官的移植实现对临床疾病的治疗。 干细胞是整个人体生长发育的基础“材料”。
脂肪干细胞生物学特性
2001年,Zuk等首次从人抽脂术抽取的脂肪组织中分离出一种多向分化干细 胞,因其与骨髓间充质干细胞(BMSC)形态相似而称为脂肪间充质干细胞 (ASC)。 脂肪干细胞具有向脂肪、骨、软骨、肌肉、内皮、造血、肝、胰岛和神经等 多种细胞方向分化的多分化潜能,是一种理想的种子细胞。因脂肪干细胞具有 分化为脂肪的潜能,且其具有易获得性、可迅速扩增、不易衰老等特点,目前 脂肪干细胞已成为脂肪组织工程中种子细胞的研究热点。 Zuk等认为,ASC可能由多种异源性细胞构成,其中包括内皮细胞、成纤维 细胞、平滑肌细胞以及前体脂肪细胞等。现有ASC主要由成纤维细胞以及来自 间叶组织的细胞构成,仅伴有少量内皮细胞与平滑肌细胞。上述细胞在ASC中 的含量甚低,不可能定向培养分化为其他组织细胞,但进一步确认和识别真正 的ASC的表面蛋白及其基因仍是必要的。
脂肪干细胞的表面标记
a)粘附分子:ADAS细胞始终表达tetraspan蛋白(CD9)、整合素β1(CD29)和 α4(CD49 d);细胞间粘附分子1(ICAM 1,CD54)、endoglin(cd102)、血管细胞 粘附分子(VCAM,CD106)及活化的淋巴细胞粘附分子(ALCAM,CD166)。但不表 达神经细胞粘附分子(NCAM,CD56)、细胞间粘附分子3(ICAM-3,CD50)、整合 素αb(CD11b)和β2(CD18)及内皮选择蛋白(E selectin,CD62); b)分子受体:可表达透明质酸盐(CD44)和转铁蛋白(CD71)的受体; c)细胞外基质蛋白和糖蛋白:ADAS细胞能生成Ⅰ和型胶原、骨桥蛋白、ostenectin 、Thy-1(CD90)和MUC-18(CD146); d)肌蛋白:能表达平滑肌细胞内的肌动蛋白和波形蛋白;e)造血细胞标记:不表达 造血细胞标志物CD14、CD31或CD45; f)补体调节蛋白:确定能表达衰变加速因子(CD55)和补体蛋白; g)组织相容性抗原:表达类组织相容性蛋白HLA-ABC,而不表达类蛋白HLA-DR。
脂肪来源间充质干细胞 (Adipose Derived Msenchymal Stem Cell, AD-MSC(ASC))
不富含CD34+细 胞,SVF培养P2之后
脂肪干细胞的鉴定
在缺少分化刺激因子的条件下,ASC表面标志蛋白有HLA-ABC、CD9、CD10、 CD13、CD29、CD34、CD44、CD49、CD54、CD55、CD59、CD105、CD146、 CD166; 经过14d的诱导培养后, ASC虽然发生了形态变化,表现出成脂细胞、成软骨细 胞、成骨细胞等分化的特征,但表面蛋白的表达却大致与未分化前一致,这些 表面蛋白与BMSC的表面蛋白很相似。 ASC和BMSC均表达CD13、CD29、CD44、CD105,均不表达CD31、CD34、 CD45、HLA-DR。虽然从分子标识上看ASC和BMSC具有相同的表面粘附分子 和受体分子,但两者仍有区别。ASC表达CD49d,而不表达CD106,BMSC则 相反,造成这种区别的机制可能与细胞所处的微环境及具体功能有关。 间充质干细胞没有特异的表面标志已得到公认。免疫组化染色和流式细胞仪检 测等免疫表型的结果对确认脂肪干细胞有辅助作用,但鉴定脂肪干细胞的最好 方法是进行多系定向诱导,并进行相应检测以确定诱导成功。
脂肪来源干细胞
脂肪来源干细胞
脂肪来源干细胞的命名
脂肪来源血管基质成分
(Stromal Vascular Fraction,SVF) 富含大量的CD34+细胞, 从脂肪组织直接获得
脂肪来源干细胞
(Adipose Derived Stem Cell, ADSC)
富含一定量的CD34+细 胞,SVF培养P0-P2
脂肪干细胞成脂分化
ASC在特定促进因素下可分化为脂肪细胞,长期培养仍可维持此种分化能力。 脂肪细胞分化过程大致如下: (1)脂肪干细胞向脂肪细胞定向分化,形成脂肪母细胞(一种尚未出现脂滴的 梭形细胞);(2)脂肪母细胞经过生长抑制、克隆性增殖,形成前体脂肪细胞 (此时细胞刚开始出现脂滴);(3)前体脂肪细胞经过生长抑制、克隆性增殖 和一系列基因表达的变化,形成不成熟脂肪细胞或多室脂肪细胞(内含大量小脂 滴);(4)多室脂肪细胞随着脂肪在细胞中的沉积,小脂滴逐渐汇集成一个大 脂滴充满脂肪细胞的大部分,形成成熟脂肪细胞或单室脂肪细胞,成为成熟的脂 肪细胞。
不同的试验结果结果有不同,但这种差异可能是在细胞分离、培养、纯正 化方法不同,以及免疫组化技术和流式细胞仪敏感性的不同而造成。总的 来说,PAL细胞的免疫表型与已经报道的骨髓间充质干细胞是相似的。
脂肪干细Βιβλιοθήκη Baidu的体外培养
脂肪干细胞在脂肪组织中含量很低,要利用脂肪干细胞就必须进 行体外分离培养扩增。常用的方法是将剪碎的脂肪组织消化离心,倾 去上层脂肪及上清,获得基质血管层,将其收集到培养瓶中培养,除 去未贴壁的红细胞和残渣,剩余的细胞群体称为加工过的脂肪吸取物 。原代培养的细胞中贴壁的细胞较少,细胞生长至融合后传代,传代 后的细胞称为脂肪干细胞。平均每300mL脂肪组织可获得2×108~ 6×108 个这样的细胞。 体外培养条件下,ASC的培养不像BMSC对培养基中胎牛血清的来 源和质量有严格要求,DMEM、αMEM、RPMI1640是ASC的常用培 养基。一般只添加体积分数为10%的胎牛血清,并且血清无生产批号 限制。在传代培养中,平均倍增时间为60h。并表现低水平衰老,1代 时细胞没有出现衰老现象,10代时少于5%细胞出现衰老,15代时衰 老细胞比例仍低于15%,这表明脂肪ASC体外扩增能力很强,传代培 养易于获得大量有分化能力的细胞。
干细胞生物学特性
干细胞(Stem cell,SC):
− 干细胞(Stem cell,SC)是有自我复制、高度增殖和多向化潜能的细胞群 体,这些细胞以通过细胞分裂维持自身细胞的大小,同时又可以进一步分 成为各种不同的组织细胞,从构成机体各种复杂的组织器官。 干细胞技术: − 又称为再生医疗技术,是指通过对干细胞进行分离、体外培养、定向诱导、 甚至基因修饰等过程,在体外繁育出全新的、正常的甚至更年轻的细胞、 组织或器官,并最终通过细胞、组织或器官的移植实现对临床疾病的治疗。 干细胞是整个人体生长发育的基础“材料”。
脂肪干细胞生物学特性
2001年,Zuk等首次从人抽脂术抽取的脂肪组织中分离出一种多向分化干细 胞,因其与骨髓间充质干细胞(BMSC)形态相似而称为脂肪间充质干细胞 (ASC)。 脂肪干细胞具有向脂肪、骨、软骨、肌肉、内皮、造血、肝、胰岛和神经等 多种细胞方向分化的多分化潜能,是一种理想的种子细胞。因脂肪干细胞具有 分化为脂肪的潜能,且其具有易获得性、可迅速扩增、不易衰老等特点,目前 脂肪干细胞已成为脂肪组织工程中种子细胞的研究热点。 Zuk等认为,ASC可能由多种异源性细胞构成,其中包括内皮细胞、成纤维 细胞、平滑肌细胞以及前体脂肪细胞等。现有ASC主要由成纤维细胞以及来自 间叶组织的细胞构成,仅伴有少量内皮细胞与平滑肌细胞。上述细胞在ASC中 的含量甚低,不可能定向培养分化为其他组织细胞,但进一步确认和识别真正 的ASC的表面蛋白及其基因仍是必要的。
脂肪干细胞的表面标记
a)粘附分子:ADAS细胞始终表达tetraspan蛋白(CD9)、整合素β1(CD29)和 α4(CD49 d);细胞间粘附分子1(ICAM 1,CD54)、endoglin(cd102)、血管细胞 粘附分子(VCAM,CD106)及活化的淋巴细胞粘附分子(ALCAM,CD166)。但不表 达神经细胞粘附分子(NCAM,CD56)、细胞间粘附分子3(ICAM-3,CD50)、整合 素αb(CD11b)和β2(CD18)及内皮选择蛋白(E selectin,CD62); b)分子受体:可表达透明质酸盐(CD44)和转铁蛋白(CD71)的受体; c)细胞外基质蛋白和糖蛋白:ADAS细胞能生成Ⅰ和型胶原、骨桥蛋白、ostenectin 、Thy-1(CD90)和MUC-18(CD146); d)肌蛋白:能表达平滑肌细胞内的肌动蛋白和波形蛋白;e)造血细胞标记:不表达 造血细胞标志物CD14、CD31或CD45; f)补体调节蛋白:确定能表达衰变加速因子(CD55)和补体蛋白; g)组织相容性抗原:表达类组织相容性蛋白HLA-ABC,而不表达类蛋白HLA-DR。
脂肪来源间充质干细胞 (Adipose Derived Msenchymal Stem Cell, AD-MSC(ASC))
不富含CD34+细 胞,SVF培养P2之后
脂肪干细胞的鉴定
在缺少分化刺激因子的条件下,ASC表面标志蛋白有HLA-ABC、CD9、CD10、 CD13、CD29、CD34、CD44、CD49、CD54、CD55、CD59、CD105、CD146、 CD166; 经过14d的诱导培养后, ASC虽然发生了形态变化,表现出成脂细胞、成软骨细 胞、成骨细胞等分化的特征,但表面蛋白的表达却大致与未分化前一致,这些 表面蛋白与BMSC的表面蛋白很相似。 ASC和BMSC均表达CD13、CD29、CD44、CD105,均不表达CD31、CD34、 CD45、HLA-DR。虽然从分子标识上看ASC和BMSC具有相同的表面粘附分子 和受体分子,但两者仍有区别。ASC表达CD49d,而不表达CD106,BMSC则 相反,造成这种区别的机制可能与细胞所处的微环境及具体功能有关。 间充质干细胞没有特异的表面标志已得到公认。免疫组化染色和流式细胞仪检 测等免疫表型的结果对确认脂肪干细胞有辅助作用,但鉴定脂肪干细胞的最好 方法是进行多系定向诱导,并进行相应检测以确定诱导成功。
脂肪来源干细胞
脂肪来源干细胞
脂肪来源干细胞的命名
脂肪来源血管基质成分
(Stromal Vascular Fraction,SVF) 富含大量的CD34+细胞, 从脂肪组织直接获得
脂肪来源干细胞
(Adipose Derived Stem Cell, ADSC)
富含一定量的CD34+细 胞,SVF培养P0-P2
脂肪干细胞成脂分化
ASC在特定促进因素下可分化为脂肪细胞,长期培养仍可维持此种分化能力。 脂肪细胞分化过程大致如下: (1)脂肪干细胞向脂肪细胞定向分化,形成脂肪母细胞(一种尚未出现脂滴的 梭形细胞);(2)脂肪母细胞经过生长抑制、克隆性增殖,形成前体脂肪细胞 (此时细胞刚开始出现脂滴);(3)前体脂肪细胞经过生长抑制、克隆性增殖 和一系列基因表达的变化,形成不成熟脂肪细胞或多室脂肪细胞(内含大量小脂 滴);(4)多室脂肪细胞随着脂肪在细胞中的沉积,小脂滴逐渐汇集成一个大 脂滴充满脂肪细胞的大部分,形成成熟脂肪细胞或单室脂肪细胞,成为成熟的脂 肪细胞。
不同的试验结果结果有不同,但这种差异可能是在细胞分离、培养、纯正 化方法不同,以及免疫组化技术和流式细胞仪敏感性的不同而造成。总的 来说,PAL细胞的免疫表型与已经报道的骨髓间充质干细胞是相似的。
脂肪干细Βιβλιοθήκη Baidu的体外培养
脂肪干细胞在脂肪组织中含量很低,要利用脂肪干细胞就必须进 行体外分离培养扩增。常用的方法是将剪碎的脂肪组织消化离心,倾 去上层脂肪及上清,获得基质血管层,将其收集到培养瓶中培养,除 去未贴壁的红细胞和残渣,剩余的细胞群体称为加工过的脂肪吸取物 。原代培养的细胞中贴壁的细胞较少,细胞生长至融合后传代,传代 后的细胞称为脂肪干细胞。平均每300mL脂肪组织可获得2×108~ 6×108 个这样的细胞。 体外培养条件下,ASC的培养不像BMSC对培养基中胎牛血清的来 源和质量有严格要求,DMEM、αMEM、RPMI1640是ASC的常用培 养基。一般只添加体积分数为10%的胎牛血清,并且血清无生产批号 限制。在传代培养中,平均倍增时间为60h。并表现低水平衰老,1代 时细胞没有出现衰老现象,10代时少于5%细胞出现衰老,15代时衰 老细胞比例仍低于15%,这表明脂肪ASC体外扩增能力很强,传代培 养易于获得大量有分化能力的细胞。