多肽固相合成法综述

多肽固相合成法综述

【摘要】：多肽是人体中重要的生命活性物质，其化学合成有着非常重要的意义。多肽固相化学合成法是蛋白质研究领域的重要的研究方法之一，近年来，由于其省时、省力、省料、便于计算机控制等优点而得到了很大的发展。本文介绍了多肽固相合成法的诞生、原理、分类、过程以及前景展望。

【关键词】：多肽；固相合成

1 概述

多肽是生物体内的具有特定功能的生命活性物质，是由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成的，其分子结构介于氨基酸与蛋白质之间。目前，多肽的化学合成法有液相法和固相法两种。固相合成法由于其省时、省力、省料、便于计算机控制等优点在药物研发领域、蛋白质结构研究领域、免疫学研究领域表现出了显著的优越性并且在生物制药及蛋白质工程中有着广阔的应用前景。

2 多肽固相合成

2.1诞生

1963年，Merrifield首次提出了多肽固相合成法（SPPS）这个具有里程碑意义的合成方法，可以说它带来了多肽化学合成上的一次革命。在这之前，大量科学家在多肽合成以及氨基酸保护方面取得了不少成绩，为多肽固相合成法的诞生提供了实验和理论基础。60年代末，Merrifield发明了世界上第一台多肽合成仪，并首次合成生物蛋白酶-具有124个氨基酸的核糖核酸酶。1984年，Merrifield也因为在多肽固相合成领域的突出贡献获得了诺贝尔化学奖。

2.2原理

将所要合成的肽链的第一个氨基酸的羧基以共价键的形式与固相载体（高分子树脂）相连接，再以结合在固相载体上的氨基酸的氨基作为合成起点，脱去氨基保护基并同过量的活化羧基反应以延长肽链，不断重复这

个步骤，即缩合成肽-洗涤-脱保护-洗涤-缩合成肽，直到得到目的肽链。最后，将肽链从树脂上裂解下来，进行氧化折叠、纯化、化学修饰等步骤得到所要的多肽。

2.3分类

多肽固相合成法有两种：一是Merrifield所建立的Boc合成法，它是采用TFA(三氟乙酸)可脱除的Boc(叔丁氧羰基)为α-氨基保护基，侧链保护采用苄醇类。合成时将一个Boc－氨基酸衍生物共价交联到树脂上，用TFA 脱除Boc，用三乙胺中和游离的氨基末端，然后通过DCC活化、偶联下一个氨基酸，最终脱保护多采用HF 法或TFMSA(三氟甲磺酸)法。在Boc合成法中，反复地用酸来脱保护，这种处理带来了一些问题：如在肽与树脂的接头处，当每次脱Boc基时会有肽从树脂上脱落，合成的肽链越长，这样的损失越严重；此外，酸处理会引起侧链的一些副反应，Boc合成法尤其不适于合成含有色氨酸等对酸不稳定的肽类。1978年，Meienlofer和Atherton等人采用Carpino报道的Fmoc(9-芴甲氧羰基)基团作为α-氨基保护基，成功地进行了多肽的Fmoc固相合成。Fmoc法与Boc法的根本区别在于采用了碱可脱除的Fmoc为α-氨基的保护基，侧链的保护采用TFA可脱除的叔丁氧基等，树脂采用90%TFA可切除的对烷氧苄醇型树脂，最终的脱保护过程避免了强酸处理。

2.4步骤

2.4.1树脂的选择、活化及氨基酸的固定

多肽固相合成的载体在合成条件下应该是惰性、不溶性的交联聚合物，能够对单体中活性基团进行选择性保护和去保护。有两种载体类型可以选择：微孔溶胀型和大孔非溶胀型，在大多数固相合成中，由于机械强度高，不易破坏，功能基化反应速度快，负载容量高的特点，溶胀型树脂优于非溶胀型树脂。根据树脂上导入反应基团的不同，将其分为氯甲基树脂、羧基树脂、氨基树脂，Boc法通常选择氯甲基树脂（Merrifield树脂），Fmoc 法通常选择羧酸树脂（Wang氏树脂）。

树脂需要活化，将其在固相反应器中用DMF浸泡溶胀两个小时，减压抽去溶剂达到活化目的。

氨基酸的固定是通过保护氨基酸的羧基同树脂的反应基团间形成共价键实现的。氯甲基树脂，通常先制的保护氨基酸的四甲铵盐，然后在适当温度下直接同树脂反应或在合适的有机溶剂中反应；羧基树脂，加入适当的缩合剂使被保护氨基酸与树脂形成共酯以完成固定；氨基树脂则是在加入缩合剂后，通过保护氨基酸与树脂间形成酰胺键完成固定过程。

2.4.2氨基、羧基、侧链的保护及脱除

氨基是亲核性很强的基团，经酰化后亲核性消失达到保护的目的。常用的氨基保护基有Fmoc（9-芴甲氧羰基）,Boc(叔丁氧羰基)等：Fmoc基团对酸稳定，可被碱脱除，且有着特征性紫外吸收，易于监测，给自动化带来方便；Boc可在酸性条件下被除去，产物容易分离，且二者都不易发生消旋，给纯化带来方便。因为，Fmoc对酸很稳定，所以可用哌啶-CH2Cl2或者是哌啶-DMF脱去；Boc则可以直接通过TFA（三氟乙酸）直接脱保护。

羧基通常用成酯来保护，与相应的醇形成甲酯或是乙酯都是常用方法，除去保护基团时的方法因物而异，例如叔丁酯在酸性条件中除去，苄酯用催化氢化法除去等等。

某些多肽侧链所带的功能基团会在合成时发生副反应，给合成带来麻烦，此时也需要用适当的保护基团将其保护起来，保证侧链基团不参与反应，不被破坏且在最后肽链裂解时能被除去。例如，酪氨酸中的酚羟基是活泼基团，常用BrZ(2-溴苯氧羰基)进行保护，它对亲核试剂和TFA十分稳定，需用强酸脱除；对碱极不稳定，20%哌啶中完全解离。

2.4.3肽键的形成

在多肽固相合成中，肽键的形成是有一定条件的。首先为保证能够得到单一的多肽，必须要求每一步的缩合尽可能完全，不仅反应速度要快，更重要的是保护基和肽与树脂的连接在整个肽键形成过程中的稳定；再者，必须将羧基活化才能形成酰胺键，通常可以将羧基活化成酰氯、活泼酯、酸酐等。下面介绍两种常用的接肽方法：

1.原位法

又称为DCC法，它是直接加入DCC（二环己基碳二亚胺）和保护氨基

酸到树脂中进行反应的方法。优点是操作简便，反应速度快，产率高，但是缺点也很明显，副产物DCU在溶剂DCM中的溶解度很小，需消耗大量时间和溶剂进行多次洗涤，但仍旧会有少量残存于树脂孔隙中，活化和缩合在一起进行时它有连接到肽链上的可能，从而影响目标多肽的纯度。

2.对称酸酐法

可以说是DCC法的改进加强版。在加入羧基组分前先加入DCC的反应步骤，活化中间体一部分由羧基先与DCC反应生成对称酸酐，产物纯度好，反应后的产物不存在副产物DCU，反应速度快且对称酸酐可以以结晶的形式存在，利于保存。对称酸酐法也有缺陷，由于制备一分子酸酐需要两分子的保护氨基酸，因此保护氨基酸的用量比较大，另外，这种方法对树脂溶胀性的要求也比较高。

2.4.4未反应氨基的封闭

由于在固相合成中，第一轮缩合循环所留下的未反应的氨基会在第二轮缩合循环中继续和羧基反应从而产生肽链内部缺少某些氨基酸的内缺失肽。因为它的理化性质和产物非常接近，给目标多肽的纯化带来极大不便。为避免这种情况，通常选择封闭氨基，常用方法有：用酸酐或是乙酰咪唑乙酰化，用甲酰异丙烯酯甲酰化，荧光胺反应，3-硝基邻苯二甲酸酐反应，3-磺酸丙酸的内酸酐反应。

2.4.5多肽的切除、沉淀及纯化

树脂用DCM洗涤几次，真空抽干，向装有树脂的多肽固相反应器中缓慢加入TFA/TIS/H20的混合溶液充分反应。一段时间后，用氮气出去大部分的溶剂，向残液中加入无水乙醚出现白色絮状沉淀。在一定的温度和压强下，离心去除杂质。最后将沉淀真空干燥，冷冻保存。进一步的纯化过程则需采用高效液相色谱、毛细管电泳等技术进行。

3 结论

多肽固相合成法历经四十余年的发展已经在生物制药、生物化学、免疫学、分子微生物学等众多领域取得了丰硕的成果，但是这种方法也存在着一定的局限性。目前，我们合成的多肽链长度受一定的限制，另外合成中的副产品依旧困扰着我们等等这些问题仍旧需要我们去克服。尽管如此，