酶联免疫吸附双抗体夹心法PPT课件
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则要与酶标记特异性抗体作用。
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双抗体夹心法图示
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+ห้องสมุดไป่ตู้
双抗体夹心法测抗原 -
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三、实验仪器&试剂
仪器
全自动酶标仪、全自动酶标洗板机
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试剂
待测血清、抗-AFP-L3 抗体、封闭蛋白溶液、辣根过 氧化物酶（HRP）、底物四甲基联苯胺（TMB)、显色 液、终止液…… OR: 甲胎蛋白（AFP）定量测定试剂盒（酶联免疫法）
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ELISA的三条基本原理
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原理一
ELISA的基础是抗原（或抗体）的固相化及抗原（或抗体）的 酶标记。结合在固相载体表面的抗原（或抗体）仍保持其免疫 学活性。
原理二
抗原(或抗体)可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种 酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性。
原理三
固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶 反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本 中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定 量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结 果，使测定方法达到很高的敏感度。
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酶联免疫吸附双抗体夹心法
测定血清中甲胎蛋白含量
临床八年1205班2组 陈旭 陈楷 李皓
一、实验目的
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1 掌握酶联免疫吸附实验（ELISA）的原理
2 熟悉酶联免疫吸附实验的操作方法
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二、实验原理
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基础知识
1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者 Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发 展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法， 即酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 。ELISA现在 已成为目前分析化学领域中的前沿课题 ，它是 一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术 ( immunoenzymatic techniques ) 的基础上 发展起来的一种新型的免疫测定技术。
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四、实验步骤
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获得AFP未标定抗体
将AFP抗体与固相 载体连接形成固相抗体
加入封闭蛋白溶液以封闭载体 表面残留的蛋白结合位点
洗涤除去未结合的 抗体及杂质
洗涤并除去未结合的封闭蛋白
加血清形成 固相抗体－抗原复合物
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2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作 相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl ，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5 倍）。加样将样品加于酶 标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30 分钟。 4. 配液：将20 倍浓缩洗涤液用蒸馏水20 倍稀释后备用 5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，如此重复5 次，拍干。 6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7. 温育：操作同3。 8. 洗涤：操作同5。 9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀 ，37℃避光显色15 分钟. 10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11. 测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。 测定应在加终止 液后15 分钟以内进行。
双抗体夹心法
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方法
用已知抗体包被，加入待测抗原，再加酶标抗体，加底物 显色。
固相(包被)抗体Ab + 样品(抗原Ag) + 酶标抗体Ab * → Ab-Ag-Ab* + 底物(TMB)→显色
应用
这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位， 因为其一端要与包被于固相载体上的抗体作用，而另一端
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甲胎蛋白（α fetoprotein，AFP）
一种含4%碳水化合物的单链糖蛋白，分子量70KD，半衰期 5天，由592 个氨基酸残基的单肽链组成。基因位于第4对 染色体4q1124q21区域，由 15 个外显子和14个内含子组 成，属于血清中一种α球蛋白，是一种胚胎性相关蛋白。 自1963年发现以来，作为一种肿瘤特异性抗原已广泛应用 于临床。它对原发性肝癌的早期诊断具有重要意义，同时 对肝细胞癌的鉴别诊断，流行病学调查和理论研究都很有 价值。
详细步骤
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1. 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10 孔，在第一、第 二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl ，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl 分别加到第三孔和第四孔， 再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四 孔中先各取50μl 弃掉，再各取50μl 分别加到第五、第六孔中，再在第 五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六中各 取50μl 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀 释液50μ，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl 加到第九、第十孔中， 再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取 50μl 弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为（1800ng/L ， 1200ng/L，600ng/L，300ng/L， 150ng/L）。
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SUCCESS
THANK YOU
2019/7/20
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洗涤除去其他 未结合的物质
加HRP酶标抗体生成 抗体—待测抗原—酶标记抗体
的复合物
加底物四甲基联苯胺(TMB) 进行酶催化反应
彻底洗涤未结合 的HRP酶标抗体
根据颜色反应的程度 进行AFP的定量测定
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待测血清、抗-AFP-L3 抗体、封闭蛋白溶液、辣根过 氧化物酶（HRP）、底物四甲基联苯胺（TMB)、显色 液、终止液…… OR: 甲胎蛋白（AFP）定量测定试剂盒（酶联免疫法）
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ELISA的三条基本原理
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原理一
ELISA的基础是抗原（或抗体）的固相化及抗原（或抗体）的 酶标记。结合在固相载体表面的抗原（或抗体）仍保持其免疫 学活性。
原理二
抗原(或抗体)可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种 酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性。
原理三
固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶 反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本 中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定 量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结 果，使测定方法达到很高的敏感度。
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酶联免疫吸附双抗体夹心法
测定血清中甲胎蛋白含量
临床八年1205班2组 陈旭 陈楷 李皓
一、实验目的
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1 掌握酶联免疫吸附实验（ELISA）的原理
2 熟悉酶联免疫吸附实验的操作方法
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二、实验原理
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基础知识
1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者 Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发 展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法， 即酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 。ELISA现在 已成为目前分析化学领域中的前沿课题 ，它是 一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术 ( immunoenzymatic techniques ) 的基础上 发展起来的一种新型的免疫测定技术。
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四、实验步骤
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获得AFP未标定抗体
将AFP抗体与固相 载体连接形成固相抗体
加入封闭蛋白溶液以封闭载体 表面残留的蛋白结合位点
洗涤除去未结合的 抗体及杂质
洗涤并除去未结合的封闭蛋白
加血清形成 固相抗体－抗原复合物
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2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作 相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl ，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5 倍）。加样将样品加于酶 标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30 分钟。 4. 配液：将20 倍浓缩洗涤液用蒸馏水20 倍稀释后备用 5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，如此重复5 次，拍干。 6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7. 温育：操作同3。 8. 洗涤：操作同5。 9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀 ，37℃避光显色15 分钟. 10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11. 测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。 测定应在加终止 液后15 分钟以内进行。
双抗体夹心法
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方法
用已知抗体包被，加入待测抗原，再加酶标抗体，加底物 显色。
固相(包被)抗体Ab + 样品(抗原Ag) + 酶标抗体Ab * → Ab-Ag-Ab* + 底物(TMB)→显色
应用
这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位， 因为其一端要与包被于固相载体上的抗体作用，而另一端
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甲胎蛋白（α fetoprotein，AFP）
一种含4%碳水化合物的单链糖蛋白，分子量70KD，半衰期 5天，由592 个氨基酸残基的单肽链组成。基因位于第4对 染色体4q1124q21区域，由 15 个外显子和14个内含子组 成，属于血清中一种α球蛋白，是一种胚胎性相关蛋白。 自1963年发现以来，作为一种肿瘤特异性抗原已广泛应用 于临床。它对原发性肝癌的早期诊断具有重要意义，同时 对肝细胞癌的鉴别诊断，流行病学调查和理论研究都很有 价值。
详细步骤
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1. 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10 孔，在第一、第 二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl ，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl 分别加到第三孔和第四孔， 再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四 孔中先各取50μl 弃掉，再各取50μl 分别加到第五、第六孔中，再在第 五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六中各 取50μl 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀 释液50μ，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl 加到第九、第十孔中， 再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取 50μl 弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为（1800ng/L ， 1200ng/L，600ng/L，300ng/L， 150ng/L）。
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洗涤除去其他 未结合的物质
加HRP酶标抗体生成 抗体—待测抗原—酶标记抗体
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加底物四甲基联苯胺(TMB) 进行酶催化反应
彻底洗涤未结合 的HRP酶标抗体
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