同工酶测定

保护酶（SOD、POD、CAT、APX）同工酶分析

酶液提取：称取1g样品鲜叶，在冰浴条件下加酶提取液（0.1 mol·L-1 Tris-HCl 缓冲液pH8.0（每100ml内含半胱氨酸0.073g、抗坏血酸0.105g、EDTANa20.075g、甘油10ml、1mol·L-1HCl 5.84ml）2ml，研磨至匀浆，然后在低温冷冻离心机中4℃、13000r·min-1离心20min，上清液极为酶提取液。

电泳（邹琦，2000）：采用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行同工酶分析，分离胶浓度POD、CAT为7.5%，SOD、APX为10%，浓缩胶浓度为3%（配方如表1）。电泳时采用稳流控制，SOD、POD、CAT电泳浓缩胶为15mA/板，分离胶20mA/板；APX电泳浓缩胶、分离胶均为30mA/板，电泳缓冲液中加入2mmol·L-1抗坏血酸，上样前预电10min。电泳至溴酸蓝标志到达凝胶前沿为止。

酶谱染色：根据酶反应的专一性，采用不同的染色方法，进行同工酶酶谱分析。

SOD同工酶的染色方法：采用四氮唑蓝（NBT）法（胡能书，1985）染色。电泳完毕后，取下胶片，用无离子水冲洗干净，然后依次浸入下述染色液中：（1）把电泳完毕后的胶片放在A液（2.45mmol·L-1 NBT溶液）中于黑暗下浸20min；（2）在B液（含有28μmol·L-1核黄素、2.8mmol·L-1四甲基乙二胺的36mmol·L-1 pH7.8 磷酸缓冲液）中于黑暗下浸15min；（3）在C液（含10mmol·L-1 EDTA的0.05mol·L-1 pH7.8 磷酸缓冲液）中浸泡并于40W日光灯下照光至出现清晰透明的SOD同工酶谱带。染色后的胶片洗掉浮色后，可保存在7%的醋酸溶液中，供分析、照相、亦可制成干板永久保存。

表1聚丙烯酰胺凝胶电泳胶板配置方法

Table 1 Gel and dyeing solution compounds

药剂分离胶10% 分离胶7.5% 浓缩胶3%

30%Acr 9.75 ml 7.3 ml 1 ml

1%Bis 7.50 ml 5.6 ml 1 ml 分离胶缓冲液 3.75 ml 3.75 ml

浓缩胶缓冲液 2.5 ml 蒸馏水8.80 ml 13.15 ml 5.43 ml

POD 同工酶电泳染色：采用联苯胺溶液染色法（邹琦，2000）。称取0.1g 联苯胺，加入少量乙醇溶解，依次加入5mol·L -1 HAC 10ml ，15mol·L -1 NaAC 10ml ，H 2O 70ml ，最后加入3-5滴H 2O 2，将此显色液倾入20cm 培养皿中，待电泳凝胶片加入后不断搅动，观察各条带显色的先后，照像或画出POD 同工酶谱带，最后用7%醋酸固定。

CAT 同工酶的染色方法：采用淀粉法（张宪政，1994）染色。将1%可溶性淀粉溶液于沸水浴中充分煮沸至无色透明。胶片脱下后放入上述溶液中4℃浸泡1小时40分钟。倾出淀粉液加入0.5%过氧化氢溶液，室温静置1min ，然后用双蒸馏水漂洗几次，加入0.5%碘化钾溶液（取1g ，用双蒸馏水定容至200ml ，加1ml 冰醋酸使之酸化），将漂洗好的胶片放入。室温下背景逐渐变蓝色，酶活处无色透明，清晰后立即以蒸馏水漂洗，并迅速照相，记录，以防谱带消失。

APX 同工酶的染色方法：采用Rao 等（1995）的方法染色。首先，用含有的2mmol·L -1抗坏血酸的50mmol·L -1磷酸钠缓冲液（pH7.0）进行平衡30min ，然后用含有4mmol·L -1抗坏血酸和2mmol·L -1 H 2O 2的50mmol·L -1磷酸钠缓冲液（pH7.0）进行温育20min ，在用100mmol·L -1磷酸钠缓冲液（pH7.5）冲洗1min ，显色液为含有28mmol·L -1 TEMED 和 2.45mmol·L -1 NBT 的磷酸钠缓冲液（pH7.8），温和摇动，10min 后即可根据显色情况用蒸馏水冲洗中止反应，对图像进行观察、保存和分析。

测量相对迁移率（Rf ）：分离区带速率是以相对迁移率来表示的。染色后，用游标卡尺量出指示剂移动的距离和酶带移动的距离。

迁移率（Rf ）=溴酚兰前沿的距离

样品带移动的距离 10%过硫酸铵

0.20 ml 0.2 ml 0.07 ml TEMED 15 μl 15 μl 5 μl