结核病诊断 T-SPOT 实验

95.9% (47/49) 32
92.0% (1139/1238)
结核杆菌
T-SPOT.TB
TST
All Studies of Specificity in Subjects in Low Endemicity Settings
n "Specificity" (100-A)% n "Specificity" (100-A)%
RD1基因在BCG以及大部分环境分枝杆菌中缺失。
29
T-SPOT试验
γ干扰素 检ຫໍສະໝຸດ Baidu阴性
γ干扰素 检测阳性
TB抗原多肽
T细胞
活化T细胞
γ 干扰素
30
步 骤
31
T-SPOT
T-SPOT灵敏度
Reference
Sensitivity
Jafari et al 2006 AJRCCM 174;9:1048-53
84.2% (32/38)
Goletti et al. PLoS ONE. 2008. 3; 10: e3417.*
89.9% (62/69)
Bosshard et al. Respir Med. 2008. [Epub ahead of print]
98.4% (62/63)
Higuchi Med Microbiol Immunol. 2008. [Epub ahead of print]* TOTAL
80.8% (80/99) 85.7% (36/42) 94.1% (254/270)
Vincenti et al Clin Exp Immunol. 2007 Oct;150(1):91-8*
84.6% (11/13)
Wang et al Emerging Infect Dis 2007 13;4:553-8
12
接触活动性结核病患者
暴露程度不足，结核杆菌被机体免疫力清除
机体被感染
- 没有症状,结核杆菌仍旧 存在而不能被检测
- X-光/ CT 扫描显示正常
- 没有抗体应答
- 诊断困难
- 传统的结核感染检测只有 TST（PPD）
受机体免疫力抑制 没有临床症状
活动性结核与潜伏感染
5%
5%
再次激活
有临床症状 具有传染性
Lalvani et al Am J Respir Crit Care Med 2001; 163: 824-28 † 26 100.0%
La•lva特ni et a异l J In性fect D高is 2001 183;3: 469-7 †
40 100.0%
Pa只tha针n et对al J结Imm核un分ol 2枝001杆; 167菌: 52复17-合522群5 †敏感，与绝3大2 多数10环0.0境% 分枝杆菌和卡介苗（BCG）
- 结核杆菌可以通过涂片、 培养检测出
- 胸部的 X-光或 CT 扫 描显示异常
- 肺外结核难以诊断 (特别是儿童)
终身处于感染状态
潜伏感染
活动性结核
13
结核病—诊断
实验室检查
影像检查
+ 临床 指征
病理检查
14
02
结核杆菌实验室检查
结核诊断--临床应用
+ 几乎所有的临床内科科室 都需要结核的鉴别诊断：
26
PPD--结核菌素试验
A、变态反应尚未建立； B、免疫抑制如应用皮质 激素或营养不良等
3)结核菌素试验的意义 阴性：无结核菌感染；不能排除结核感染。 阳性：曾有结核感染，并不一定现在患病。 强阳性：活动性结核病可能
27
PPD--结核菌素试验
PPD试验临床价值
PPD所含抗原为致病性分枝杆菌、环境分枝杆菌及卡介苗菌 株所共有，其结果受到卡介苗接种及其他分枝杆菌感染的影 响，特异性较差。
01
结核病实验室检查及意义
汇 报 人：
培训专业：呼吸内科
指导老师：
02
2016.12.14
目录
01. 分枝杆菌概述 02. 结核病实验室检查 03. 小结
2
01
分枝杆菌概述
3
分枝杆菌属分类
➢结核分枝杆菌(M.tuberculosis) ➢非结核分枝杆菌（NTM） ➢麻风分枝杆菌（M.leprae）
98.3% (57/58)
Clarke et al Clin Exp Immunol 2007 150(2):238-44.
90.0% (27/30)
高的检出率 Detjen et al CID 2007 1;45(3):322-8*
Ozekinci et al J Int Med Res 2007;35:696-703
10
结核病发病机制
起始期
结核分枝杆菌通过飞沫进入呼吸道，被肺泡巨噬细胞吞噬杀灭， 不留任何痕迹和感染证据。 特点：不存在结核杆菌复制，不存在免疫周围细胞的免疫应答
反应期
结核分枝杆菌在体内复制，形成感染灶，由T细胞介导的细胞免 疫和迟发型变态反应，进一步清除细菌。
特点：激活体内免疫反应（CMI和DTH），宿主获得抗结核抵抗力
24
免疫学检查
细胞免疫学检查 PPD--结核菌素试验
迟发型细胞超敏反应 1）方法：1:2000 OT或PPD液0.1毫升(5单位)，左
前臂屈侧中部皮内注射，48-72h测量皮肤硬结的直
径。
25
PPD--结核菌素试验
2）判断标准：
阴性≤4mm 弱阳性5-9mm 阳性10-19mm， 强阳性≥20mm 或局部出现水泡与坏死
87.2% (34/39)
Losi et al Eur Respir J. 2007 Dec;30(6):1173-9
100.0% (10/10)
Kim et al Arch Intern Med 167;20:2255-2259
100.0% (22/22)
Connell et al PLoS ONE 2008. 3; 7:e2624*
▪需时长，根据接种量的大小，一般2-8周才能得到肉眼可见菌落。 ▪结果受标本保存运送时间、培养基成分和质量、前处理方法等影响， 操作较直接涂片法复杂，需经严格培训 。 ▪需培养基凝固灭菌器、离心机、涡旋振荡器、恒温培养箱等设备。 ▪成本是直接涂片法的7-8倍。
23
细胞免疫学检查
+ 结核菌素皮肤试验（PPD试验） + γ干扰素释放试验（T-SPOT试验）
阳性培养
BACTEC™ MGIT™ 960/320 指示器系统
O2
O2
O2CO2
O2 O2 O2 OC2OC2O2OO2 2
上部空间
已预先充填10% CO2
肉汤
改良Middlebrook 7H9肉汤
O2 O2
O2 O2 O2 CO2
FFFOOF22OFFF2OO2F2FFOO22
传感器
对氧气高度敏感的钌复合物
细菌学检查 涂片镜检
适用于多种标本；操作简便，价格低廉。 2份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性； 1份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性+肺部影像学检查符合活动性肺结核表现。 肺结核治疗评估的主要依据之一
18
结核分枝杆菌-实验室检查
缺点：不能区别是否为非结核分枝杆菌 不能区别死活菌。 结核杆菌暴露于异烟肼时，某些条件会失去抗酸性，出现假阴性。 检测灵敏度较低（104-105 个细菌/毫升）。
4
结核分枝杆菌的发现
1882年 德国柯赫医生发现结核致病菌----结核杆菌
5
结核杆菌的变迁
1897年提出结核病的飞沫传播 1922年，卡介苗为预防结核病 首次对新生儿接种 1945年，链霉素的问世使肺结 核不再是不治之症。 ……
6
结核分枝杆菌—特点
(M.tuberculosis)
生物学主要特点： 1. 细胞壁中含有大量脂质 2.引起的疾病都呈慢性 并伴肉芽肿 3.抗酸染色阳性
•灵敏度 Meier et al EJCMID 2005 24;529-536
Kang et al Chest. 2007 Sep;132(3):959-65*
91.3% (21/23) 95.9% (70/73) 92.2% (59/64)
基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很 Janssens et al ERJ 2007 30(4):722-8
92.9% (26/28) 92.9% (26/28)
Soysal et al IJ美TLD国20F08D1A2(数1):据50-：56*灵敏度95.6%(175/183)
Dominguez et al Clin Vacc Immunol 2008 15(1);168-71*
Chee et al J Cli国n M内icro临bio床l. 2数008据A：pr 9灵* 敏度95.3%(624/655)
Ch无apm交an叉et a反l AID应S 2002 16;2285-93 †
40 100.0%
Adams et al美Sca国ndFJ DInfAect数Dis据. 2：008特;40异(3):性1969-270.31.%(297/30168) 100.0% Bocchino et a国l Eu内r J临Clin床M数ircro据In：fect特Dis异(2性0089) 4M.a1y%10(*478/50498) 89.8% 50 84.0%
7
结核病
+ 由结核分枝杆菌引起的慢性感染性疾病
8
结核病—临床表现
症状
体征
1.全身症状：消瘦、 盗汗、低热、乏力 2.呼吸系统症状：咳 嗽、约1/3咯血 3结核变态反应表现
因肺结核好发于 肺上叶尖后段及 下叶背段，故锁 骨上下、肩胛间 区叩诊音浊
9
结核病发病机制
起始期 T细胞反应期 共生期 细胞外增殖期和传播期
– 发热待查，结核排筛 – 结脑的鉴别诊断 – 胸腹水患者待查 – 儿童结核
16
结核杆菌
结核病 实验室检查
细菌学检查
分枝杆菌分离培养 分支杆菌药敏试验 分枝杆菌菌种鉴定
体液免疫学诊断
免疫学检查
细胞免疫学诊断
分子生物学检查
DNA测序 DNA探针技术 聚合酶链反应（PCR）
17
结核分枝杆菌-实验室检查
当出现免疫功能低下时可出现假阴性结果，敏感性低。 免疫力正常的阴性有一定意义。强阳性有一定意义。有结 核变态反应、淋巴结核强阳性多。 经济、简便，可以用于流行病学大规模的筛查和普查，但 存在着明显的缺陷。
28
T-SPOT实验
细胞免疫学检查 T-SPOT试验原理
结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞再次受到 结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（IFN-γ）。 因此，检测效应T淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断。 既用抗体捕获培养中细胞所分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色方式 将其表现出来。 刺激抗原：ESAT-6蛋白(早期分泌抗原靶6） 、CFP-10蛋白（培养滤液蛋白） 由结核分枝杆菌特有的RD1基因编码，可刺激活化的效应T淋巴细胞产生γ干扰素。
11
结核病发病机制
共生期
在低氧、低pH、抑制性脂肪酸和宿主免疫机制共同作用下抑制细菌的增殖。 结核分枝杆菌未被完全清除，细菌和宿主处于共生状态，结核杆菌主要存 在于坏死组织中央。特点：可激发和维持T细胞的免疫记忆，在一定条件 下再次发病
增殖 传播期
长期休眠的结核细菌在一定条件下，再次增殖，突破宿主免疫屏障，引起结核病 特点：结核播散
100.0% (12/12)
Ferrara et al Lancet 2006 376;1328-34*
83.3% (20/24)
Lee et al Eur Respir J 2006 28;24-30*
96.6% (84/87)
Goletti et al Clin Microbiol Infect 2006 12;6:544-50*
19
结核杆菌培养
细菌学检查 痰培养、其他标本培养
+ 传统方法：L-J固体培养基 + 快速培养法:
检测细菌生长过程中代谢产生的CO2或消耗的O2，显微镜直接观 察、变色液体培养基等BACTEC MGIT960系统 BACTEC460系统、、Bact/ALERT 3D、ESPⅡ等。
20
结核杆菌培养
阴性培养
100.0% (9/9)
Kobashi et al. Scand J Infect Dis 2008. 40; 8: 629-34*
87.5% (42/48)
Kobashi et al. J Infect. 2008 [Epub ahead of print].*
90.0% (36/40)
Domínguez et al. Diagn Microbiol Infect Dis. 2008.* [Epub ahead of print]
FFO2F
F F
F
F F FO2 F
无或微弱荧光
强荧光
21
结核杆菌培养 结核菌培养临床价值—确诊结核
1份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性+ 1份痰标本结核分枝杆菌培养 痰涂片阴性，肺部影像学检查符合活动性肺结核影像学表现
+1份痰标本结核分枝杆菌培养阳性
用于耐多药结核疗效判定
22
抗酸杆菌培养优缺点
▪敏感性较直接涂片法高，理论上10-100条菌/毫升可检出阳性； ▪特异性较直接涂片法高，可以从菌落生长速度、色素产生初步判断非 结核分枝杆菌； ▪分离出具有活力的纯培养物，为进一步药敏试验提供基础。