利用哺乳动物细胞表达外源蛋白的研究进展

利用哺乳动物细胞表达外源蛋白的研究进展

哺乳动物细胞是表达具有天然活性蛋白的最佳宿主其优势在于能正确有效地识别真核蛋白的合成、加工和分泌信号，识别和去除基因中的内含子，再经剪切加工成为成熟的mRNA，能准确地完成糖基化、磷酸化，形成链内和链间二硫键及蛋白水解等翻译后加工过程，因而产生的完整抗体和天然抗体一样，具有生物学活性，既可识别抗原又可激活补体系统。哺乳动物细胞易被重组的DNA转染，经过筛选可得到转化的细胞，具有遗传稳定性和可重复性．表达的产物分泌到培养基中易于纯化。利用哺乳动物细胞表达蛋白产物已广泛应用于生物制品工业，如病毒疫苗、抗体、干扰素、免疫调节剂、激素、和生长因子等的大量制备。

1．哺乳动物细胞宿主的选择

哺乳动物细胞表达外源蛋白最初是将抗体基因重新导人淋巴细胞中由病毒(如SV40)或lgG的启动子增强子引导。产生的抗体具有相应的结合能力和数应功能，但表达量很低。常用的非淋巴细胞类有中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、COS细胞、小鼠NSO胸腺瘤细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞等。不同宿主细胞表达的重组蛋白其稳定性和蛋白糖基化类型不同，需根据要表达的目的蛋白选择最佳的宿主细胞。COS细胞是进行外源基因瞬时表达时用途最广的宿主，其重组载件易于组建，便于使用，而且对插入DNA 的量或者采用基因组DNA序列的情况都没有什么限制，便于通过检测表达情况来确证cDNA的阳性克隆，也利于快速分析引入克隆化cDNA序列中的突变。CHO细胞则利于外源基目的稳定整合，易于大规模培养，能在无血清和蛋白的条件下生比，是用于真核生物基因表达软为成功的宿主细胞。已用于多种复杂的重组蛋白的生产，但其产量较低，一般仅占细胞蛋白的2.5%，而用细菌表达可获得占总蛋白50%的蛋白表达水平，但大肠杆菌表达的动物蛋白能进行正确的翻译后加工如糖基化和三维结构的形成，不具有与天然抗体相似的功能活性，且在人体内易于清除。如果需要表达具有生物学功能的膜蛋白或分泌型蛋白，例如细胞表面的受体或细胞外的激素和酶，则不能在原棱细胞中表达。而哺乳动物细胞表达的蛋白则具有天然蛋白的生物学活性。为提高哺乳动物细胞的蛋白表达量，需选择合适的表达载体和有效的启动子和增强子。

2．载体类型

哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的感染。利用质粒转染获得稳定的转染细胞需几周甚至几个月时间，而利用病毒表达系统则可快速感染细胞，在几

天内使外源基因整合到病毒载体中，尤其适用于从大量表达产物中检测出目的蛋白。目前常用的可将目的基因导^哺乳动物细胞表达的病毒载体分为两类：整合型如SV40病毒载体、反转录病毒载体和游离型如痘苗病毒、腺病毒载体。利用Sindbis virus(SV)、Scmliki Forest virus(sFV)和痘苗病毒载体感染哺乳动物细胞表达的蛋白在结构与功能上与天然哺乳动物来源的蛋白更相似。Liljestrom等利用SFV病毒载体感染哺乳动物细胞获得的外源蛋白占细胞总蛋白的。载体的选择取决于外源基因的导人方式和其调控元件是否有利于转录和翻译。真核生物基因高表达载体必须具有如下调控元件：①原核DNA序列，包括能在大肠杆菌中自身复制的复制子，便于筛选含萤组细菌的抗生素抗性基躅，以及便于目的基因插入的限制性酶切位点。目前采州的哺乳动物细胞表达戟体大都带有来自pBR322的衍生质粒如pX[3、pBRd和pM[的原核序列；②启动子和增强子；

③剪接信号；④终止信号和poIyA加尾信号。为了将含目的基因的载体导入哺乳动物功物细胞．还必须加入遗传选择标记。常用的标记基因有胸腺激酶(tk)基因、二氢叶酸还原酶(dh]r)基因、新霉素(neo)抗性基因、氯霉素乙酰基转移酶(cat)基因等dhfr还可作为共扩增基因使外源基因的表达产物增加。当培养基中逐新增加氨甲蝶呤(MTX)的浓度时，随着细胞对MTX抗体的增加。dhfr基因与外源基因均明显扩增。据文献报道，在不断提高的选择压力下，dhfr及侧翼序列能扩增至上千个拷贝，大大增加目的基因的表达水平。

3．载体元件

外源基因在哺乳动物细胞中的表达与多种因素有关，主要是启动子和增强子的强弱以及它们之间的搭配。启动子需包含两个识别序列：mRNA转录起始点和TATA盒。TATA盒位于转录起始值点上游25--30bp处，是引导RNA聚合酶在正确起始位点转录所必需的序列，即保证转录的精确起始。其他上游启动子元件常位于TATA盒上游100~200bp之间。其功能是调节转录的起始频率和提高转录效率。启动于和增强子受细胞类型的限制，在不同的细胞系中有很大不同，因此需根据宿主细胞的娄型选择不同的启动子和增强子以便于目的基因的高效表达。常用的启动子有SV40、Rou肉瘤病毒RSV和巨细胞病毒CMV 的启动子。常用的增强子有Rous肉癯病毒基因长末端重复序列和人巨细胞病毒增强子。james等利用糖皮质类周醇诱导的鼠乳房瘤病毒(MMTV)启动子和鼠乳房痛病毒长末端重复序列(MMTV-LTR)，在CHO细胞中表达分泌的碱性磷酸酶，产量为利用常规的SV40和CMV启动子的10倍，超过0.4mg/ml。另外，在哺乳动物细胞中已发现存在大量在低氧环境中可诱导转录的基因，如编码红细胞生成素(EPO)转铁蛋白、血红素加氧酶-1等的

基因，它们都有一个共同的顺式作用元件(CGTG)，有利于在5’或3’侧翼区的低氧诱导低氧诱导作用因子-1(HIF-1)和低氧反应增强子(HRE)结合，激活靶基因的转录，在低氧浓度下可使重组蛋白大量表达。据报道红细胞生成素启动子在1%氧浓度比在21%氧浓度下活陛增强100倍。这又是一种新的提高表达量的作用机制。

4．提高蛋白表达产量的措施

哺乳动物细胞对培养环境十分敏感，营养和生长因子缺乏、缺氧、病毒感染、毒性代谢物的积累、机械搅动以及培养压力的增加等很多固素都可诱导细胞凋亡。大量细胞的死亡严重影响蛋白的表达产量。现已证实，有些基因能抑制细胞凋亡，如Bcl-12和BcI-x 能抑制许多因素诱发的细胞凋亡，以及某肿瘤细胞从贴壁培养转入悬浮培养而诱发的细胆凋亡。A1ison等报道，感染dSsVCAT病毒载体的BHKBcl-12和CHOBcI-x细胞生存期均延长数倍。BHKBel2、HHKBcI-x均使感染SFVIIl!的细胞恢复生长到对数生长期的细胞感染后可存活达9d，LL12的产量提高一倍。有些化学制剂也能抑制不同阶段的细胞凋亡，如乙酰半胱氨酸tNAC、吡咯烷二硫氨基甲酸酯（PDTC)等以及caspase抑制剂Z-VADfmk、YVAD，cmk等，从而大大增加表达蛋白的产量。如利用NAC和z-VADfmk的细胞培养，表达蛋白的产量分别提高2.2和3.9倍。细胞凋亡的抑制不仅延长细胞的存活期，提高蛋白的产量，而且有利于下游的纯化过程。

在细胞大规模培育过程，细胞的持续大量增殖使蛋白表达很快进入衰退期。同时由于营养缺乏，细胞大量死亡使细胞产品的产量下降，死亡的细胞释放蛋白酶和糖苷酶使表达产物降解，产品质量下降。为获得产物的大量有效表达，必须控制细胞在达到最适表达产物期停止增殖。现已发现四环素抑制表达系统(Tctoff)可严格控制细胞增殖过程。外源基因和抑制细胞生长的基因(如P27)在同一个双顺反子表逸单位，在可稠节的启动子(Totoff)作用下使细胞增殖期与增殖抑制产物表达期分开。细胞生长和产物表达都能达到最大程度。Totoff基因表达系统的优点在于毒性低，作用快，不影响哺乳动物细胞的代谢过程。由于四环素很不稳定，易于氧化脱水、芳香基化和表易构化作用，使Tot基因表达系统成为一个高效、无毒、具有严密开关功能(Trtswitch)的可诱导性基因表达系统，仅受四环素初浓度的影响，终产物中四环素自发降解，有利于下游的纯化过程。这种Tel基因表达系统控制的蛋白表达方式，因使细胞生长期和产物袁达期分开而适用于生产使细胞具有代谢负担或毒性的蛋白产物。mazur等报道利用该系统，在作用于细胞周期的激酶抑制子p27诱导下，使CHO细胞成功地达到持续生长抑制期，表达分泌型碱性磷酸酶SEAP(一种典型的外源糖蛋白)水平提高10~15倍。