产蛋白酶优良腐乳生产菌毛霉的分离筛选与鉴定
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分离初筛获得的 3 株较优菌株投入豆腐坯发 酵 复 筛 ，菌 株 HM-2 的 生 长 发 酵 情 况 最 好 ，结 果 见 表1。
表 1 菌株在豆腐坯上生长发酵情况 Tab.1 Growth and fermentation of strain on bean curd block
菌号 LSJ-1 LSJ-7 HM-2
ZHANG Bei-bei1，2，3， SONG Ping1，2，3*， WANG Zhu1，2，3， ZHANG Xiao-juan1，2，3， ZHOU Guang-yan1，2，3， WANG Ju-ying1，2，3
（1.Sichuan Academy of Food and Fermentation Industries，Chengdu 611130，China； 2.Southwest Center of Industrial Culture Collection in China，Chengdu 611130，China； 3.Sichuan Microbiological Resource Infrastructure & Culture Collection Center，Chengdu 611130，China）
Abstract： Thirty -six Mucor strains were isolated，purified and obtained from different sources fermented tofu．Three Mucor strains with high -yield of proteinase were obtained by screening with the method of transparent zones. The best producing strain HM -2 was gain by using fermentation test on tofu. It was identified as Actinomucor elegans based on morphological characteristis and ITS sequence． Key words： Mucor； proteinase； ITS sequence doi：10.3969/j.issn.1674-506X.2012.04-026
2.3.2 菌种的分子生物学鉴定 2.3.2.1 ITS 序列扩增
对 复 筛 优 选 出 的 HM-2 菌 株 的 ITS 序 列 PCR 扩增产物用 1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测， 电泳 结果显示在约 650bp 处有一条荧光带， 条带干净无 明显拖尾现象，说明 PCR 扩增成功，能满足后续测
94
第 48 卷（总第 170 期）
张蓓蓓等：产蛋白酶优良腐乳生产菌毛霉的分离筛选与鉴定
93
毛坯。 1.2 培养基 1.2.1 分离培养基（PDA）
马铃薯汁 100mL，葡萄糖 2g，琼脂 2g。 1.2.2 透明圈法初筛培养基
脱脂乳 1.5g，琼脂 2g，pH 6.0。 1.2.3 发酵法复筛培养基
享和持续利用，为生产、科研及教学提供所需要的微 生物菌种资源。
本试验拟通过对三个不同来源地的腐乳毛坯进 行菌种分离纯化， 收集筛选出产蛋白酶的优良毛霉 菌株，不仅可应用于腐乳等食品加工，还能广泛应用 于医药、饲料、化学工业、废物处理等方面［4］。 1 材料与方法 1.1 菌种分离源
系成都市温江区采集的 3 个不同来源地的腐乳
腐乳在我国具有悠久的历史， 是一种传统的大 豆蛋白发酵食品。 制作腐乳的毛霉能释放出丰富的 蛋白酶，具有消除苦味、形成鲜味物质的作用，是腐 乳生产过程中必不可少的微生物 。 ［1-3］
四川省微生物资源平台菌种保藏中心作为一个 基础性、公益性的微生物资源共享服务平台，其宗旨 和任务是对食品、发酵、医药、轻化工、环保及农产品 加工等领域应用的微生物菌种资源进行收集、保存、 鉴定、评价与管理，最大限度的实现资源的保护、共
（2）显 微 特 征 ：于 光 学 显 微 镜 下 观 察 孢 子 与 菌 丝，孢子圆形、光滑或稍粗糙，菌丝无横隔、无假根， 见图 1（B）、图 1（C）。
A
B
C
图1 菌株HM-2的菌落特征和显微特征 Fig.1 Morphological and Colony characteristics of the strain HM-2
将继代培养后的菌种转接到 PDA 平板上，25℃ 培养 3d，观察记录菌落特征，并进行显微观察［5］。 1.6.2 分子生物学鉴定
基因组 DNA 提取：参照易润华的方法［6］提取。 PCR 反 应 引 物 ： 正 向 引 物 ：ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC -3′ ， 反 向 引 物 ：ITS5：5′ GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′。
PCR 反应体系（50μL）为：10×PCR bufier 5μL、 dNTP 1μL、 MgCl2 （25mmol/L）1μL、 正 、 反 向 引 物 （20mmol/L）各 1μL、Taq 酶 （5U/μL）0.5μL、模 板 DNA 2.5μL、超纯水补足 50μL。
PCR 反 应 条 件 ：94℃ 预 变 性 5min，94℃ 变 性 30s，50℃ 退 火 1min，72℃ 延 伸 1min， 进 行 35 个 循 环，最后 72℃延伸 10min。
关键词：毛霉；蛋白酶；ITS 序列
中 图 分 类 号 ：TQ925+.2
文 献 标 识 码 ：A
文 章 编 号 ：1674-506X（2012）04-0092-0003
Isolation and Identification of High Yield Proteinase Strain for Sufu mucor
菌丛高度 1.6cm 1.8cm 2.1cm
颜色 纯白色 纯白色 纯白色
长势 致密 致密 茂盛致密
气味 淡清香 淡清香
清香
2.3 菌种的鉴定 对 发 酵 复 筛 选 出 的 HM-2 菌 株 进 行 分 类 学 鉴
定。 2.3.1 形态学鉴定
（1）菌落特征：在 PDA 培养基上，25℃培养 24h， 出现白色绒毛菌丝，菌丝体较疏松，菌落直径 2cm； 72h，菌落质地疏松，呈棉絮状或绒毛状，菌落直径约 6cm，菌丝体细密，呈雪白色，见图 1（A）。
PCR 产 物 由 上 海 英 骏 生 物 技 术 有 限 责 任 公 司 完成测序。
2 结果与分析 2.1 菌种分离初筛
从 3 个不同来源地的腐乳 毛 坯 中 分 离 获 得 36 株毛霉菌株，分别点植于脱脂乳平板上，培养 2d 后 观察菌株产透明圈情况， 测定透明圈直径和菌落直 径，直径比值（D/d）大于 2.0 的菌株有 16 株，其中 3 株达到 2.3。 2.2 菌种发酵复筛
采用透明圈法。挑取分离的毛霉菌株孢子，点植 于脱脂乳平板中央，置于 25℃培养 2d，观察菌落周 围是否产生透明圈，并测量透明圈与菌落的直径，透 明圈直径与菌落直径比值较大的菌株即为产蛋白酶 能力较强的菌株。 1.5 菌种的复筛
将初筛选出的菌株培养并制成菌悬液， 均匀涂 抹在豆腐坯上，每块接种 2mL，于 25℃条件下培养， 观测其生长发酵情况。 1.6 菌种的鉴定 1.6.1 形态学鉴定
本试验根据毛霉菌株的生长特性及功能特点， 对 3 个不同来源地的腐乳毛坯进行毛霉菌株的分离 纯化，通过透明圈检测，初筛选出 3 株产蛋白酶能力
2012 年第 4 期
M
1
2
3
2000bp 1500bp
750bp 500bp 200bp 100bp
M为分子量标准,1为阳性对照，2为菌株的ITS序列，3为阴性对照
Food and Fermentation Technology 第 48 卷（第 4 期） Vol.48，No.4
产蛋白酶优良腐乳生产菌毛霉的分离筛选与鉴定
张蓓蓓 1，2，3，宋萍 1，2，3*，王柱 1，2，3，张晓娟 1，2，3，周光燕 1，2，3，王菊英 1，2，3
（1.四川省食品发酵工业研究设计院，成都温江 611130；2.中国工业wk.baidu.com生物菌种保藏管理中心西南菌种站，成都温江 611130； 3.四川省微生物资源平台菌种保藏中心，成都温江 611130）
序的需要。 2.3.2.2 ITS 序列测定
将 HM-2 的 ITS 的扩增产物进行测序， 结果见 表 2。 2.4.2.3 ITS 序列比对
将 测 得 的 ITS 序 列 在 GenBank 数 据 库 中 进 行 同源序列搜索（BLAST），结果见表 3 。
从表 3 可以看出，菌株 HM-2 与雅致放射毛霉 的 ITS 序列相似性达到 99％以上，与其中三株 Actinomucor elegans ATCC 46123，CBS 111562，ATCC 52370 的 ITS 序列相似性达到 100%，序列号分别为 AM745430，AB113009，AM745432。 3 小结
摘 要：从 3 个不同来源地的腐乳毛坯中分离纯化获得 36 株毛霉菌株，通 过 透 明 圈 法 初 筛 选 出 3 株 产 蛋 白 酶 能 力 较
强的菌株，发酵复筛选出 1 株腐乳优良生产菌 HM-2，依据形态学结合 ITS 序列分析，该菌株 HM-2 鉴定为雅致放射毛
霉（Actinomucor elegans）。
将豆腐切成 2cm×2cm×2cm 小块， 装入已灭过 菌的 250mL 三角瓶中，每瓶一块。 1.3 菌种的分离
采用稀释分离法。 取 5g 腐乳毛坯于三角瓶中， 加入 100mL 无菌生理盐水，搅拌摇匀，将 菌 悬 液 接 入 PDA 培养基中，25℃培养，根据毛霉形态学特征， 挑取生长速度快、菌丝茂盛、纯白的单菌落。 1.4 菌种的初筛
图2 PCR扩增产物电泳图 Fig.2 The electtophoresis of PCR amplification products
表 2 菌株 HM-2 的 ITS 序列 Tab.2 The ITS sequence of the strain HM-2.
1 CCACCTGATT TCAGATCAAG TTGTTGAATG TTTTCTTTGG GAGGCCCCCA AGGCAATAAT 61 AAAGTTCTAG TTCGCAAGAG CTTTCGCTTG AAATTAAGAA AAAGTTCAGG CGCAATCAAA 121 CTTTGGCTTG CAGGCCTTTA GTCATTTAAA GCGTCTCCGG GCTAGAGATT TTACTTCTAA 181 GCCAGATACC CTCAATGTCC CCTTAAGAAA AAAATCTTAA GGGAAGAGTT GTTTCTGATA 241 CTGAAACAGG CGTACCTGCT GGAATACCAG CAGGTGCAAG ATGCGTTCAA AGACTCGATG 301 ATTCACTGAA TATGCAATTC ACACTAGTTA TCGCACTTTG CTACGTTCTT CATCGATGCG 361 AGAACCAAGA GATCCGTTGT TAAAAGTTGT TTTATAGGCC ACCTTTCAGC GAGCCCATGT 421 TACAATATTA ATACTGAATT CATTTGGTAG AATAATTAAT TTTTGGGGTA CCAAGCTGAA 481 AAAAAGTCGG CTTGACCATG GCTTCGATTA AAATCATCCT GTGCCGCCTA CCCCGTATGG 541 TGGCTCAGGC ATCTCTACTA GCGCCATGCT ATAAGACAGT TCACGGTAAA AAATAAGAGA 601 AAAACCAAGC CCGTAAGCTC AGTTTCCCCT CAAGTTTTAT TTAATGATCC TTCCGCAGGT 661 TCACCTACGG AAACCTTGTT
收 稿 日 期 ：2012-06-27 基金项目：“四川省微生物资源共享平台” 作 者 简 介 ：张 蓓 蓓 （1982-），女 ，硕 士 ，工 程 师 ，从 事 微 生 物 菌 种 资 源 开 发 、 利 用 、 保 藏 及 标 准 化 整 理 工 作 。 * 通讯作者：宋萍（1958-），教授，四川省微生物资源平台菌种保藏中心主任，http://www.sc-sicc.org.cn
表 1 菌株在豆腐坯上生长发酵情况 Tab.1 Growth and fermentation of strain on bean curd block
菌号 LSJ-1 LSJ-7 HM-2
ZHANG Bei-bei1，2，3， SONG Ping1，2，3*， WANG Zhu1，2，3， ZHANG Xiao-juan1，2，3， ZHOU Guang-yan1，2，3， WANG Ju-ying1，2，3
（1.Sichuan Academy of Food and Fermentation Industries，Chengdu 611130，China； 2.Southwest Center of Industrial Culture Collection in China，Chengdu 611130，China； 3.Sichuan Microbiological Resource Infrastructure & Culture Collection Center，Chengdu 611130，China）
Abstract： Thirty -six Mucor strains were isolated，purified and obtained from different sources fermented tofu．Three Mucor strains with high -yield of proteinase were obtained by screening with the method of transparent zones. The best producing strain HM -2 was gain by using fermentation test on tofu. It was identified as Actinomucor elegans based on morphological characteristis and ITS sequence． Key words： Mucor； proteinase； ITS sequence doi：10.3969/j.issn.1674-506X.2012.04-026
2.3.2 菌种的分子生物学鉴定 2.3.2.1 ITS 序列扩增
对 复 筛 优 选 出 的 HM-2 菌 株 的 ITS 序 列 PCR 扩增产物用 1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测， 电泳 结果显示在约 650bp 处有一条荧光带， 条带干净无 明显拖尾现象，说明 PCR 扩增成功，能满足后续测
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第 48 卷（总第 170 期）
张蓓蓓等：产蛋白酶优良腐乳生产菌毛霉的分离筛选与鉴定
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毛坯。 1.2 培养基 1.2.1 分离培养基（PDA）
马铃薯汁 100mL，葡萄糖 2g，琼脂 2g。 1.2.2 透明圈法初筛培养基
脱脂乳 1.5g，琼脂 2g，pH 6.0。 1.2.3 发酵法复筛培养基
享和持续利用，为生产、科研及教学提供所需要的微 生物菌种资源。
本试验拟通过对三个不同来源地的腐乳毛坯进 行菌种分离纯化， 收集筛选出产蛋白酶的优良毛霉 菌株，不仅可应用于腐乳等食品加工，还能广泛应用 于医药、饲料、化学工业、废物处理等方面［4］。 1 材料与方法 1.1 菌种分离源
系成都市温江区采集的 3 个不同来源地的腐乳
腐乳在我国具有悠久的历史， 是一种传统的大 豆蛋白发酵食品。 制作腐乳的毛霉能释放出丰富的 蛋白酶，具有消除苦味、形成鲜味物质的作用，是腐 乳生产过程中必不可少的微生物 。 ［1-3］
四川省微生物资源平台菌种保藏中心作为一个 基础性、公益性的微生物资源共享服务平台，其宗旨 和任务是对食品、发酵、医药、轻化工、环保及农产品 加工等领域应用的微生物菌种资源进行收集、保存、 鉴定、评价与管理，最大限度的实现资源的保护、共
（2）显 微 特 征 ：于 光 学 显 微 镜 下 观 察 孢 子 与 菌 丝，孢子圆形、光滑或稍粗糙，菌丝无横隔、无假根， 见图 1（B）、图 1（C）。
A
B
C
图1 菌株HM-2的菌落特征和显微特征 Fig.1 Morphological and Colony characteristics of the strain HM-2
将继代培养后的菌种转接到 PDA 平板上，25℃ 培养 3d，观察记录菌落特征，并进行显微观察［5］。 1.6.2 分子生物学鉴定
基因组 DNA 提取：参照易润华的方法［6］提取。 PCR 反 应 引 物 ： 正 向 引 物 ：ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC -3′ ， 反 向 引 物 ：ITS5：5′ GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′。
PCR 反应体系（50μL）为：10×PCR bufier 5μL、 dNTP 1μL、 MgCl2 （25mmol/L）1μL、 正 、 反 向 引 物 （20mmol/L）各 1μL、Taq 酶 （5U/μL）0.5μL、模 板 DNA 2.5μL、超纯水补足 50μL。
PCR 反 应 条 件 ：94℃ 预 变 性 5min，94℃ 变 性 30s，50℃ 退 火 1min，72℃ 延 伸 1min， 进 行 35 个 循 环，最后 72℃延伸 10min。
关键词：毛霉；蛋白酶；ITS 序列
中 图 分 类 号 ：TQ925+.2
文 献 标 识 码 ：A
文 章 编 号 ：1674-506X（2012）04-0092-0003
Isolation and Identification of High Yield Proteinase Strain for Sufu mucor
菌丛高度 1.6cm 1.8cm 2.1cm
颜色 纯白色 纯白色 纯白色
长势 致密 致密 茂盛致密
气味 淡清香 淡清香
清香
2.3 菌种的鉴定 对 发 酵 复 筛 选 出 的 HM-2 菌 株 进 行 分 类 学 鉴
定。 2.3.1 形态学鉴定
（1）菌落特征：在 PDA 培养基上，25℃培养 24h， 出现白色绒毛菌丝，菌丝体较疏松，菌落直径 2cm； 72h，菌落质地疏松，呈棉絮状或绒毛状，菌落直径约 6cm，菌丝体细密，呈雪白色，见图 1（A）。
PCR 产 物 由 上 海 英 骏 生 物 技 术 有 限 责 任 公 司 完成测序。
2 结果与分析 2.1 菌种分离初筛
从 3 个不同来源地的腐乳 毛 坯 中 分 离 获 得 36 株毛霉菌株，分别点植于脱脂乳平板上，培养 2d 后 观察菌株产透明圈情况， 测定透明圈直径和菌落直 径，直径比值（D/d）大于 2.0 的菌株有 16 株，其中 3 株达到 2.3。 2.2 菌种发酵复筛
采用透明圈法。挑取分离的毛霉菌株孢子，点植 于脱脂乳平板中央，置于 25℃培养 2d，观察菌落周 围是否产生透明圈，并测量透明圈与菌落的直径，透 明圈直径与菌落直径比值较大的菌株即为产蛋白酶 能力较强的菌株。 1.5 菌种的复筛
将初筛选出的菌株培养并制成菌悬液， 均匀涂 抹在豆腐坯上，每块接种 2mL，于 25℃条件下培养， 观测其生长发酵情况。 1.6 菌种的鉴定 1.6.1 形态学鉴定
本试验根据毛霉菌株的生长特性及功能特点， 对 3 个不同来源地的腐乳毛坯进行毛霉菌株的分离 纯化，通过透明圈检测，初筛选出 3 株产蛋白酶能力
2012 年第 4 期
M
1
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2000bp 1500bp
750bp 500bp 200bp 100bp
M为分子量标准,1为阳性对照，2为菌株的ITS序列，3为阴性对照
Food and Fermentation Technology 第 48 卷（第 4 期） Vol.48，No.4
产蛋白酶优良腐乳生产菌毛霉的分离筛选与鉴定
张蓓蓓 1，2，3，宋萍 1，2，3*，王柱 1，2，3，张晓娟 1，2，3，周光燕 1，2，3，王菊英 1，2，3
（1.四川省食品发酵工业研究设计院，成都温江 611130；2.中国工业wk.baidu.com生物菌种保藏管理中心西南菌种站，成都温江 611130； 3.四川省微生物资源平台菌种保藏中心，成都温江 611130）
序的需要。 2.3.2.2 ITS 序列测定
将 HM-2 的 ITS 的扩增产物进行测序， 结果见 表 2。 2.4.2.3 ITS 序列比对
将 测 得 的 ITS 序 列 在 GenBank 数 据 库 中 进 行 同源序列搜索（BLAST），结果见表 3 。
从表 3 可以看出，菌株 HM-2 与雅致放射毛霉 的 ITS 序列相似性达到 99％以上，与其中三株 Actinomucor elegans ATCC 46123，CBS 111562，ATCC 52370 的 ITS 序列相似性达到 100%，序列号分别为 AM745430，AB113009，AM745432。 3 小结
摘 要：从 3 个不同来源地的腐乳毛坯中分离纯化获得 36 株毛霉菌株，通 过 透 明 圈 法 初 筛 选 出 3 株 产 蛋 白 酶 能 力 较
强的菌株，发酵复筛选出 1 株腐乳优良生产菌 HM-2，依据形态学结合 ITS 序列分析，该菌株 HM-2 鉴定为雅致放射毛
霉（Actinomucor elegans）。
将豆腐切成 2cm×2cm×2cm 小块， 装入已灭过 菌的 250mL 三角瓶中，每瓶一块。 1.3 菌种的分离
采用稀释分离法。 取 5g 腐乳毛坯于三角瓶中， 加入 100mL 无菌生理盐水，搅拌摇匀，将 菌 悬 液 接 入 PDA 培养基中，25℃培养，根据毛霉形态学特征， 挑取生长速度快、菌丝茂盛、纯白的单菌落。 1.4 菌种的初筛
图2 PCR扩增产物电泳图 Fig.2 The electtophoresis of PCR amplification products
表 2 菌株 HM-2 的 ITS 序列 Tab.2 The ITS sequence of the strain HM-2.
1 CCACCTGATT TCAGATCAAG TTGTTGAATG TTTTCTTTGG GAGGCCCCCA AGGCAATAAT 61 AAAGTTCTAG TTCGCAAGAG CTTTCGCTTG AAATTAAGAA AAAGTTCAGG CGCAATCAAA 121 CTTTGGCTTG CAGGCCTTTA GTCATTTAAA GCGTCTCCGG GCTAGAGATT TTACTTCTAA 181 GCCAGATACC CTCAATGTCC CCTTAAGAAA AAAATCTTAA GGGAAGAGTT GTTTCTGATA 241 CTGAAACAGG CGTACCTGCT GGAATACCAG CAGGTGCAAG ATGCGTTCAA AGACTCGATG 301 ATTCACTGAA TATGCAATTC ACACTAGTTA TCGCACTTTG CTACGTTCTT CATCGATGCG 361 AGAACCAAGA GATCCGTTGT TAAAAGTTGT TTTATAGGCC ACCTTTCAGC GAGCCCATGT 421 TACAATATTA ATACTGAATT CATTTGGTAG AATAATTAAT TTTTGGGGTA CCAAGCTGAA 481 AAAAAGTCGG CTTGACCATG GCTTCGATTA AAATCATCCT GTGCCGCCTA CCCCGTATGG 541 TGGCTCAGGC ATCTCTACTA GCGCCATGCT ATAAGACAGT TCACGGTAAA AAATAAGAGA 601 AAAACCAAGC CCGTAAGCTC AGTTTCCCCT CAAGTTTTAT TTAATGATCC TTCCGCAGGT 661 TCACCTACGG AAACCTTGTT
收 稿 日 期 ：2012-06-27 基金项目：“四川省微生物资源共享平台” 作 者 简 介 ：张 蓓 蓓 （1982-），女 ，硕 士 ，工 程 师 ，从 事 微 生 物 菌 种 资 源 开 发 、 利 用 、 保 藏 及 标 准 化 整 理 工 作 。 * 通讯作者：宋萍（1958-），教授，四川省微生物资源平台菌种保藏中心主任，http://www.sc-sicc.org.cn