中空纤维超滤膜浓缩水解胶原蛋白

在单位体积膜组件中，中空纤维膜的有效膜面积最大，过滤分离效率高，容易清洗，结构简单，操作方便。

中空纤维超滤膜浓缩水解胶原蛋白
一、实验目的：
掌握超滤膜分离的原理，了解超滤膜分离浓缩实验操作的主要工艺参数。

二、超滤膜分离的基本原理：
超滤膜的材料主要有有机高分子材料和无机材料两大类。

在本实验中使用的是纤维素酯类。

该类物质的超滤膜亲水性好，成孔性好，材料来源方便、易得。

但这种材料耐酸碱性差(适合pH＝4－6)，也不适用于酮类、酯类和有机溶剂。

在一定的压力作用下，当含有高分子和低分子溶质的混合溶液流过超滤膜表面时，溶剂（如水）和低分子溶质将会透过超滤膜，作为超滤液被收集；高分子溶质则被超滤膜截留作为浓缩液被收集。

需要指出的是，在上述情况下，是根据超滤膜孔径的大小来作为截留的依据。

但在有些情况下，一些小于膜孔径的分子仍然会被截留。

明胶是猪皮或牛皮中的水溶性胶原蛋白，其平均分子量在30KDa之间，不能通过截留分子量为6KDa的超滤膜。

蛋白酶选择性水解明胶分子中的酰胺键，降低其分子量。

经过蛋白酶的部分水解，明胶平均分子量降低至3-5KDa，能够通过上述超滤膜，因此，可用超滤膜进行分离。

酰胺键在碱性条件下可与双缩脲试剂反应，产生蓝紫色，在520nm有最大吸收。

在适当范围内，酰胺键的数量与蓝紫色呈正相关。

此反应可用于快速测定蛋白质的含量。

三、实验设备及溶液的配置：
1.实验设备：
(1) 中空纤维超滤膜组件
型号：SL－2型
截流分子量：6000
膜面积：0.5M2
适宜流量：10－50L/h
组件结构如图所示。

(2)722s型可见分光光度计。

2. 超滤料液的配制：
量取蛋白质浓度为30%（m/mL）的水解明胶100mL，用纯净水稀释至3500mL-5000mL，搅拌均匀后用少量硅藻土助滤剂做滤层进行真空抽滤，收集滤液备用。

四、实验步骤：
1．检漏：将储液槽内装满清水，打开1＃阀门，使磁力泵充满液体，通电启动，关闭各管路出口阀门，检查各接口是否漏液。

2. 将储液槽用蒸馏水清洗干净（用pH试纸测流出液pH为7时即可）。

清洗用蒸馏水从16＃阀门放出。

3. 将料液放入储液槽中。

4. 打开1#、3#、4＃、8＃、13＃、14＃、15＃阀门，接通电源，开启超滤膜分离装置进行分离。

注意流量及压强的变化。

5. 超滤15分钟后分别打开A和10＃阀门收集超滤滤过液、超滤截留液（另附页）。

6.按双缩脲法测定其中的蛋白质浓度（另附页）；按照甲醛法测定其平均分子量。

7. 722s型可见分光光度计简单操作法
在520nm波长下用722s型可见分光光度计测定的吸光度。

首先接好电源，将测定的波长置于520nm，打开暗箱，预热20分钟。

将参比液（蒸馏水）放入光路，调节到透光率T ＝100％处，显示100.0，在吸光率A处，显示0.000。

将待测液放入光路即可进行测量。

8.系统清洗：打开4#、6＃和B2放掉残流在系统中的料液，接通清洗水系统，开泵运行首先用弱碱液进行清洗，洗至流出液无色后，用蒸馏水清洗至pH＝7。

⒐加保护液（1％的甲醛水溶液）：停泵，放净系统中的清洗水，打开B2，从保护液槽加入保护液。

五、思考题
1. 解释为什么要测定超滤滤过液和截留液的平均分子量？
2. 在实验结束时加保护液有何作用？
3.甲醛法测定氨基酸含量的原理是什么？
2、甲醛法测定其平均分子量
1）中性甲醛的配置
取分析纯甲醛10ml，用0.01mol/L NaOH溶液调pH 8~9
（2）甲醛法测蛋白质分子量
取10ml待测液，用蒸馏水溶至50ml。

搅拌下用0.01mol/L NaOH调节pH 8～9。

加入10ml 中性甲醛溶液后，搅拌30min。

用0.01mol/L NaOH滴定，使pH 8～9，记录VNaOH 平均分子量计算：
M=M×1.174×S×1000/（C×V）
M—质量（固含量/10），S—脱水后的固含量（蛋白质含量/100），
C—NaOH浓度，V—NaOH体积，
甲醛法测定平均分子质量的原理：
二、原理
水溶液中的氨基酸为兼性离子，因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。

甲醛可与氨基酸上的—N+H3结合，形成—NH—CH2OH、—N(CH2—OH)2等羟甲基衍生物，使N+H3上的H+游离出来，这样就可以用碱滴定N+H3放出H+，测出氨基氮，从而计算氨基酸的含量。

若样品中只含有单一的已知氨基酸，则可由此法滴定的结果算出氨基酸的含量。

若样品中含有多种氨基酸（如蛋白质水解液），测不能由此法算出氨基酸的含量。