HPLC法测定牛磺熊去氧胆酸含量

HPLC法测定牛磺熊去氧胆酸含量

摘要：目的采用反相高效液相色谱法测定牛磺熊去氧胆酸的含量。方法用Welchrom C18 （250mm×4.6mm，5μm）柱为分析柱，乙腈：缓冲液（磷酸二氢钾与庚烷磺酸钠混合溶液）（37：63，V/V）为流动相；检测波长为210nm。结果最低检出限为0.3ng，定量限为1ng；线性范围0.01～0.75mg/ml （r=0.9999）；重复性实验RSD为1.1%。结论本方法准确、简便，可用于测定牛磺熊去氧胆酸的含量。

关键词：牛磺熊去氧胆酸含量牛磺鹅去氧胆酸

牛磺熊去氧胆酸（Tauroursodeoxycholic Acid，C26H45NO6S.2H2O）是最新的第三代口服胆汁酸，是熊去氧胆酸与牛磺酸的共轭体，其亲水性较熊去氧胆酸高，溶石速度更快，全部溶解率提高，安全性更好。其含量测定方法多采用酸碱滴定法，但误差较大，文献报道中也有采用HPLC法测定含量的，但基本上都是采用甲醇与磷酸盐的混合溶液作为流动相，该方法存在重现性不够好且峰形较差的缺点，我们通过实验，对检测方法进行改进，获得了较好的效果。

1、仪器及试药

日本岛津LC-10A液相色谱仪（SPD-10A VP Plus UV-VIS检测器）；TU-1800SPC紫外分光光度计（北京普析通用仪器公司）。

磷酸二氧钾、庚烷磺酸钠、盐酸、氢氧化钠、双氧水等均为AR级；甲醇为色谱级。牛磺熊去氧胆酸钠对照品（中国药品生物制品检定所，批号110816-200507，含量100%，供含量测定用）；牛磺熊去氧胆酸工作对照品（本公司提供TAU091229）；牛磺熊去氧胆酸样品（本公司提供TAU091222，TAU091223，TAU091228）；牛磺熊去氧胆酸（东京化成工业株式会社，试药，Lot.GD31）；牛磺鹅去氧胆酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号110846-200405）。

2、方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Welchrom C18（250mm×4.6mm，5μm）柱为分析柱，乙腈：缓冲液（取磷酸二氢钾3.4g，庚烷磺酸钠0.506g，加水至500ml，混匀）=37：63（V/V）为流动相；检测波长为210nm。

2.2 色谱条件的选择

2.2.1 检测波长及流动相的选择

通过对牛磺熊去氧胆酸的水溶液紫外测定，发现其只有末端吸收，仪器噪音水平高，灵敏度较低，为了保证检测灵敏度同时避免噪声的干扰，选择210nm 为检测波长。采用乙腈：缓冲液（取磷酸二氢钾3.4g，庚烷磺酸钠0.506g，加水至500ml，混匀）=37：63（V/V）为流动相，出峰时间合适，峰形好。（图1）A牛磺熊去氧胆酸钠（中检所）

B牛磺熊去氧胆酸（日本）

C牛磺熊去氧胆酸工作对照品

D牛磺鹅去氧胆酸（中检所）

图1 样品色谱图

2.2.2 专属性考察

取本品100mg置于10ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，作为贮备液备用。

酸破坏试验

移取储备液1.0ml至10ml容量瓶中，加1M HCl 1.0ml于80℃水浴上反应2hrs后，加1M NaOH 1.0ml中和，加流动相至刻度，即得。主峰能与杂质及降解产物完全分离。

碱破坏试验

移取储备液1.0ml至10ml容量瓶中，加1M NaOH 1.0ml，于80℃水浴上反应2hrs后，加1M HCl 1.0ml中和，加流动相至刻度，即得。主峰能与杂质及降解产物完全分离。

氧化破坏试验

移取储备液1.0ml至10ml容量瓶中，加30%过氧化氢0.5ml反应10min后，加流动相至刻度，即得。主峰能与杂质及降解产物完全分离。

加热破坏试验

移取储备液1.0ml至10ml容量瓶中，于80℃水浴上反应2hrs后，加流动相至刻度，即得。主峰能与杂质及降解产物完全分离。

强光照射试验

于照度4500Lx强光下放置10天后，用流动相制成1mg/ml的供试液，取20μl 进行HPLC检查。结果显示强光照射条件下产生的降解产物与主成分峰有很好的分离度。

高湿：取本品适量于室温，相对湿度85%条件下放置24小时，取出检查。主峰能与杂质及降解产物完全分离。

通过上述实验，结果表明，该法灵敏度高，测定精度高，主峰与各杂质分离良好，专属性强。

2.2.3 线性关系

称取牛磺熊去氧胆酸对照品适量，加流动相溶解并稀释制成系列浓度的溶液，分别进样20μl。以浓度C为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归。回归方程式为A=3087518C+12543.7（r=0.9999），线性范围为0.01～0.75mg/mL，以S/N=3计算最低检测限为0.3ng。以S/N=10计算定量限为1.0ng。

2.2.4 精密度试验

精密称取牛磺熊去氧胆酸对照品适量，用流动相溶解并稀释制成0.25mg/ml 的溶液（制备六份）进行测定，记录主峰峰面积，计算含量测定的精密度（RSD=1.1%）。

2.3 含量测定

精密称取牛磺熊去氧胆酸适量，加流动相溶解并制成每lml含0.25mg的溶液，作为供试品溶液，同法制备对照品溶液；分别量取对照溶液和供试品溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。量取主成分峰面积，以外标法计算含量。结果见表1。

2.4 牛磺鹅去氧胆酸

牛磺鹅去氧胆酸是牛磺熊去氧胆酸的异构体，由于结构类似，通常的TLC 方法不能很好对他们进行分离检测，使用该HPLC方法同时也可以用于牛磺鹅去氧胆酸的分析检测。

除样品浓度为1mg/ml，对照品浓度为0.01mg/ml外，照含量测定方法，精密量取对照品溶液和供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液若呈现牛磺鹅去氧胆酸峰，以外标法计算含量。结果见表2。

3、讨论和结论

研究表明牛磺熊去氧胆酸含量测定方法的灵敏度高，分离效果好，专属性强，含量测定结果稳定，重复性较好；同时采用本方法可以将牛磺熊去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸分离，因此也可以用于测定牛磺鹅去氧胆酸的含量，弥补了TLC方法的不足。

参考文献：

[1]王玉萍，张良，尚敏，HPLC测定熊胆滴眼剂中牛磺熊去氧胆酸的含量，中成药，2000，22（3）：199—201；

[2]张启明，殷晓建，严光东，等. 高效液相色谱法直接测定熊胆粉中牛磺熊去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸的含量[J]，药物分析杂志，1993 ，13（5）：3212323；

[3]宋志伟，吴艳玲，朴惠善，南极星，高效液相色谱法测定熊胆粉中牛磺熊去氧胆酸含量，延边大学医学学报，2007，30（1）：22-24；