高通量药物筛选利器——HTRF,在生物标志物(biomarker)中的应用

HTRF技术介绍
快速、稳定、不需洗涤、操作简单、易于自动化和微型化。

上述优势使得Cisbio的HTRF技术一直是药物研发领域的领先技术之一，并广泛用于免疫检测。

该技术已经在知名医药公司、生物技术公司和学术研究机构应用了15年以上。

HTRF（均相时间分辨荧光，Homogeneous Time-Resolved Fluorescence ）是用来检测纯液相体系中待测物的一种常用方法。

该技术结合了荧光共振能量转移（FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer）和时间分辨荧光（TRF，Time-Resolved Fluorescence)）两种技术。

这种结合将TRF的低背景特点和FRET的均相实验方
式融合在一起，使得HTRF技术拥有如下优势：实验方式Array灵活，具有很高的灵敏度和通量，实验数据稳定可靠，假阳
性率较低。

虽然HTRF也是基于TR-FRET的化学技术，但
它的许多特点把它与其它TR-FRET产品区分开来。

这些特
点包括使用了镧系元素（铕和铽），从而具有非常长的半衰
期，很大的Stroke's shift（如右图所示，Eu3+ Stroke’s
shift > 300 nm）；但是HTRF有其独特的地方，镧系元素与
络合的穴相结合，这种结合的穴状物与其它所有TR-FRET
产品使用的螯合物相比，显著增加了稳定性（可耐受低pH
值、金属离子、DMSO、EDTA等）；专利的比值测量能矫正淬灭和样品带来的干扰。

FRET技术简介
FRET技术利用了两种荧光基团的能量转移，这两种荧光基团分别称为（能量）供体和（能量）受体。

供体被外来能源激发（例如闪光灯或激光），如果它与受体在足够近的距离之内，可以将能量共振转移到受体上。

受体受到激发，发出特定波长的发射光。

将供体和受体分别与相互作用的两个生物分子结合，生物分子的结合可以将受体和供体拉到足够近的距离，产生能量转移。

由于受体分子的发射光来自于能量转移，所以在实验中不需要将未结合与已结合的分子分开，即不需要洗涤步骤。

这种均相的实验方式操作简单，而且减少了实验时间和花费。

一般地，在FRET实验中使用的供体和受体是快速荧光基团，半衰期非常短，其背景荧光较强。

背景荧光主要来自于样品成分，包括缓冲液、蛋白质、化合物和细胞裂解液。

检测到的荧光强度必须对这些自发荧光进行校正，极大地影响了实验灵敏度，并使数据分析变得复杂。

背景荧光非
常短暂（寿命为纳秒级），可以利用时间分辨荧光方法将其去除。

1
TRF技术简介Array如前所述，在生物溶液或血清中的很多化合物
和蛋白质是自发荧光的，利用传统的快速荧光
基团进行检测极大限制了实验灵敏度。

使用长
寿命的荧光基团结合时间分辨的检测方式（在
荧光激发和发射检测之间有一个时间延迟）可
将快速荧光的干扰降到最低。

时间分辨荧光（TRF）利用稀土元素中镧系元
素的独特性质。

在TRF中常用的镧系元素是钐
（Sm）、铕（Eu）、铽（Tb）和镝（Dy）。

与传统荧光基团相比，它们具有大的Stoke's shifts和非常长的发射半衰期（从微秒到毫秒），这使它们在生物学荧光应用领域中日益重要。

通过直接激发使镧系元素离子产生荧光是不容易的，因为这些离子很难吸收光子。

镧系元素必须首先与有机分子形成复合物，有机分子收集光子并通过分子内非放射过程转移到镧系元素上。

稀土元素螯合物和穴状化合物是能量收集装置的典型代表，它们收集能量并转移到镧系元素离子上，后者则发出其特征性的长寿命的荧光。

为了能够成功应用于生物学检测中，稀土元素复合物应该具有特定的性质，包括稳定性、较高的发射光产率，并且能够与生物分子连接。

除此之外，当直接在生物溶液中反应时，能够耐受荧光淬灭就显得尤为重要。

稀土元素螯合物稳定性较差，而且有的化合物可竞争螯合物活性基团，当与FRET技术结合在一起时其灵敏度也受到限制。

如果稀土元素与穴状化合物结合，许多限制因
素都可去除。

2
3
专利号：
US Patent US 5,527,684由于在该结构上的贡献，Prof. J.M. Lehn’s 在1987年获得了诺贝尔
HTRF 技术的能量供体（Donor ）和能量受体（Acceptor ） HTRF 的供体是铕穴状化合物（Eu3+ cryptate ）或Lumi4™铽穴状化合物（Tb2+ cryptate ），后者是近年与Lumiphore 公司合作的结果，激发效率更高。

两者的能量受体（Acceptor ）均可为XL665和d2。

XL665和d2激发波长为620nm ，发射波长为665nm ，位于红外光区，进一步降低了生物溶液对实验的影响（生物学成分很少在红外光区有自发荧光）。

对于铽穴状化合物来说，其受体也可以是Fluorescin 、GFP 等发绿色荧光的分子，所以可以进行双标记测量。

XL665是改良过的别藻蓝蛋白（APC ），将APC 的亚基偶联，增加了稳定性。

d2是第二代受体，光谱学特征与XL665相同，但是分子量较小，约为1KD ，可减少空间位阻对实验的影响。

当由于生物分子相互作用导致两个荧光基团接近时，在激发时被穴状化合物捕获的部分能量释放，发射波长为620nm ；另一部分能量转移到XL665或d2，发射波长为665nm 。

665nm 的发射光仅仅由donor 引起的FRET 产生。

所以，当生物分子相互作用时，有两个激发光620nm 和665nm ；当不存在相互作用时，只有620nm 一个激发光（见右图）。

穴状化合物与螯合物
穴状化合物的形成是将一个阳离子纳入到一个立体笼中。

笼能收集光然后将能量转移到核心的镧系元素。

大环的性质有利于跟镧系元素紧密相连，这种不可破的连接会形成异常稳固的复合体。

穴结构能耐受一些特殊的实验条件如大量存在的阳离子（Mg 2+和Mn 2+等）、螯合物（EDTA ）、溶剂或者温度。

从HTRF 能应用到临床诊断（TRACE®技术和Kryptor®工作站技术）就能看出它也适用于浓度高的血清（50%）。

在读板前或者孵育时加入氟离子能增强实验对大量化合物的抗干扰性。

穴没有光漂白性，多次读数后信号没有损失，因此能按照需要的次数去读，所以可以进行动力学检测。

HTRF技术的优势
∙背景低，化合物和培养基的干扰小
∙均相检测（不需要洗板），操作简单
∙实验稳定，对酸性溶液、Mg2+、Mn2+、DMSO、EDTA比较耐受，并且读数稳定24小时以上，甚至可达7天
∙应用灵活多样
∙易于实现微型化
HTRF的应用
HTRF技术被广泛应用于细胞实验和生化实验，并应用于药物研发的不同阶段，从实验方法的建立、高通量筛选（HTS），lead到hit，到临床前研究。

这是一种很灵敏且稳定的技术，可以使用384和1536孔板。

自从10年前HTRF技术进入药物研发领域以来，研究者采用该技术加快了很多基于抗体的研究，包括GPCR（受体配体结合，受体二聚化，cAMP和IP-1的检测，以及磷酸化ERK的定量）、激酶、细胞因子和生物标志物、生物过程（抗体和蛋白生产）等，以及蛋白和蛋白、蛋白和多肽、蛋白和DNA/RNA相互作用的实验。

HTRF具有与ELISA同等的检测范围和检测极限，但是它不需要洗板，可以极大地减少实验时间，所以HTRF技术可以取代大部分ELISA实验，为均相ELISA。

4
生物标志物（Biomarker）介绍
生物标志物这一概念首次出现于美国国家研究委员会（NRC）在1983年出版的红皮书《联邦政
府风险评估》中，是医药领域一个十分热门的课题。

随着对个性化用药的关注与重视，研究人员
开始致力于寻找那些在人体内因服用药物而发生相应变化的分子。

基因组学、蛋白质组学、代谢
组学及生物信息学等新兴学科的兴起，使生物标志物的研究工作也得到了长足的发展。

生物标志
物一般是指可提供客观测定和评价的一个普通生理或病理或治疗过程中的某种特征性的生化指标，通过对它的测定可以获知机体当前所处的生物学过程中的进程。

生物标记物不仅可从分子水平探
讨发病机制，而且在准确、灵敏地评价早期、低水平的损害方面有着独特的优势，可提供早期预警，很大程度上为临床医生提供了辅助诊断的依据。

同时，生物标志物作为终端替代物，还可以
帮助制药公司研发出更好更多的目标药物来治疗疾病。

例如，在医学领域，生物标志物可用于疾
病诊断（例如前列腺特异性抗原PSA可用于前列腺癌诊断）、判断疾病分期（例如恶性肿瘤的分期）或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。

Cisbio利用其专利HTRF技术，开发了适用于基础科研、初筛、复筛的生物标志物检测解决方案，主要应用于以下几方面：
∙炎症研究：主要是细胞因子，包括人肿瘤坏死因子（hTNFα、hTNFβ）、人白介素（hIL1β、hIL2、hIL6、hIL8、hIL17）和小鼠白介素（mIL17）和干扰素（IFNγ）等，
以及PEG2、LTB4、LTC4、组胺等炎症因子
∙代谢疾病研究，包括：皮质醇、醛固醇、雌二醇、睾酮、胰岛素、胰高血糖素、cGMP、载脂蛋白A1/B
∙中枢神经系统（CNS）相关疾病研究，包括：β -淀粉样蛋白、BAC1-1
炎症研究检测试剂
细胞因子（Cytokine）检测
背景简介
细胞因子是由免疫系统细胞以及其他类型细胞主动分泌的一类小分子可溶性蛋白质与多肽（图1），是除免疫球蛋白和补体之外的又一类免疫分子，包括淋巴因子、干扰素、白介素、肿瘤坏死因子、趋化因子和集落刺激因子等。

它是免疫系统细胞之间，以及免疫系统细胞与其他类型细胞间联络的核心，能改变分泌细胞自身或其他细胞的行为或性质，通过与细胞特异的膜受体而起作用。

细胞因子的主要生物学作用有：1）抗感染、抗肿瘤作用，如IFN、TNF等；2）免疫调节作用，如IL-1、IL-2、IL-5、IFN等；3）刺激造血细胞增殖分化，如M-CSF、G-CSF、IL-3等。

4）参与和调节炎症反应，如：IL-1、IL6、TNF等。

细胞因子共分六类：白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、生长因子和趋化因子。

5
图1.细胞因子网络
白细胞介素或白介素（interleukin，IL）是一组在白细胞或免疫细胞之间相互作用的细胞因子。

最早发现在白细胞中表达，作为细胞间信号传递的手段。

实际上，白细胞介素可以由多种细胞产生，免疫系统的功能在很大程度上依赖于白细胞介素。

一些罕见的白细胞介素缺陷不足都常出现自身免疫性疾病或免疫缺陷。

不同的白介素在不同的细胞中产生，其效应也各有差异（见表1）。

表1.白介素类型、产生细胞及其效应
白介素产生细胞效应
1 单核巨噬细胞，树突
状细胞，纤维母细胞
内皮细胞
T和B细胞的增殖和分化，刺激造血细胞，参予炎症反应
2 活化的T细胞T和B细胞的增殖分化，增强NK细胞，单核细胞杀伤活性
3 活化的T细胞多能造血干细胞增殖，促进肥大细胞，嗜酸，嗜碱性粒细胞增殖与分化
4 活化的T细胞B和T细胞增殖，刺激造血祖细胞增殖与分化，诱导IgE、IgG 产生
5 活化的T细胞促进B细胞增殖与分化，促进嗜酸性粒细胞增殖与分化，诱导IgA产生
6 淋巴细胞
单核细胞
纤维母细胞
促进B细胞分化、促进肝细胞产生急性期蛋白，抑制乳腺癌细
胞、刺激骨髓瘤细胞、刺激造血细胞，参与炎症
6
7 骨髓及胸腺基质细胞促进前T、前B细胞增殖，促进成熟T细胞生长，促进血小板生成
8 单核巨噬细胞
血管内皮细胞
中性粒细胞活化和趋化作用，T细胞趋化作用，促进血管生成，
参与炎症
9 活化的T 细胞促进TH产生细胞因子，促进肥大细胞增殖，刺激造血细胞
10 活化的T细胞，B细
胞单核巨噬细胞
抑制TH产生细胞因子，促朝进胸腺细胞增殖，促进B细胞增殖
11 骨髓基质细胞促进B细胞分化，刺激造血细胞，促进血小板生成
12 B细胞促进TC，NK，LAK细胞杀伤功能，透导细胞免疫
13 活化的T细胞抑制细胞因子分泌和表达，刺激B细胞增殖和CD23表达，透导IgE产生
17 外周血T细胞诱导人成纤维细胞分泌IL-6和IL-8，并促进人成纤维细胞表达细胞间粘附分子-1（ICAM-1）的表达
干扰素（Interferon，IFN）是细胞因子中的一个家族，是动物细胞受多种因素诱导（如病毒）后
分泌的具有抗病毒、抑制细胞增殖、调节免疫及抗肿瘤等作用宿主特异性蛋白质。

干扰素是一类
糖蛋白，它具有高度的种属特异性，故动物的IFN对人无效。

人体干扰素根据细胞来源分为3种类型：白细胞产生的为α型；成纤维细胞产生的为β型；T细
胞产生的为γ型。

根据干扰素的产生细胞、受体和活性等综合因素将其分为2种类型：Ⅰ型和Ⅱ型。

Ⅰ型干扰素又称为抗病毒干扰素，其生物活性以抗病毒为主。

人体内Ⅰ型干扰素有2种形式：
IFNα、IFNβ，它们分别由白细胞、纤维母细胞产生。

IFNα、β的受体为同一种分子，其基因位于
第21号染色体上，表达在几乎所有类型的有核细胞表面，因此其作用范围十分广泛。

Ⅱ型干扰素又称免疫干扰素或γ-干扰素，主要由T细胞产生，主要活性是参与免疫调节，是体内
重要的免疫调节因子。

IFNγ只有一种活性形式的蛋白质，由一条分子量为18kD的多肽链进行不
同程度的糖基化修饰而成；IFNγ的基因只有一个，位于人类第12号染色体上；IFNγ的受体与Ⅰ
型干扰素的受体无关，其基因位于第6号染色体上，但也同样表达在多数有核细胞表面。

肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）是一类能引起肿瘤组织出血坏死的细胞因子。

根
据来源和结构分为两种类型，TNF-α和TNF-β两种因子，具有相同的结合受体，均有抗肿瘤作用，也是重要的致炎因子和免疫调节因子，同时与发热和恶液质形成有关。

TNF-α主要由单核巨噬细
胞分泌；TNF-β主要由活化的T淋巴细胞分泌，又称为淋巴毒素。

TNF在体内外均能刺激IL-1的产生。

尽管两型TNF有不同的细胞来源，DNA水平上也仅有28％的核苷酸序列同源，但两者结
合于相同的膜受体，并且具有非常相似的生物学功能，TNF受体存在于几乎所有的有核细胞表面。

目前已发现两种TNF受体（TNFRⅠ和TNFRⅡ）。

TNFRⅡ的亲和力比较强，TNFRⅠ的亲和力
相对弱一些。

两者与TNF结合后产生的效应有所不同，TNFRⅠ主要增强细胞毒细胞的活性和促
进成纤维细胞生长，而TNFRⅡ主要是增进T细胞增殖。

7
实验原理
HTRF®细胞因子检测是基于双抗体夹心法（见图2），包括两个单克隆抗体（MAb）：铕标记的抗细胞因子抗体MAb1和XL665标记的抗细胞因子抗体MAb2。

MAb1和MAb2分别与细胞因子结合，发生能量共振转移，产生荧光信号，荧光信号与细胞因子的浓度成正比。

图2. HTRF细胞因子检测原理
产品特点
∙检测基于两个单克隆抗体的免疫夹心法，批次间重复性高
∙可检测细胞上清液和全细胞
∙所需样品量少（低至5µl）
∙灵敏度高（<15 pg/mL）
∙信号稳定时间：>24h
∙易于微型化到<10 μl的体系进行1536孔板操作
∙成本低
产品应用
∙细胞因子定量
∙传染病分析
∙过敏研究
∙自体免疫失调
实验流程
HTRF®细胞因子检测方法可检测细胞上清液或者全细胞，两个抗体在检测步骤中可预先混合后一起加入。

实验步骤可以是一步法或者两步法（见图3）。

8
一步法（基于细胞）：将标记抗体与细胞、化合物一起孵育，整个实验在同一块板子中进行。

两步法（基于上清液）：细胞用化合物刺激后，将上清液转移至检测板中，添加HTRF检测试剂检测细胞因子。

图3. 细胞因子检测一步法和两步法的操作步骤
产品性能
9
10
图4. NFkB 、TNF 和 IL1分别驱动IL6和
IL8基因的表达
应用实例
IL6和IL8基因的表达由NFkB 和TNF 以及 IL1信号通路来驱动（图4）。

用小分子药物或者siRNAs 阻断这些通路，用HTRF ® IL6和 IL8检测方法，得到IL6 和IL8分泌量减少的结果，可以对这些信号通路中所涉及的基因和化学抑制剂的作用和特点进行详细的研究。

HTRF ® IL6和 IL8试剂盒已经在Hela 细胞（贴壁细胞）、THP1（悬浮细胞）以及原代人外周血淋巴细胞（PBL ）中进行了验证，在几个小时内即可对这些细胞因子完成时间进程和剂量反应的研究。

（来自 H.Niggli and al. International Cytokine Society meeting. October 2004, San Juan (Puerto Rico)）
图5显示了分别基于细胞和上清液的HTRF 细胞因子检测：TNFα（panel A ），IFNγ（panel B ），IL1β（panel C ），和IL6（panel D ）。

实验过程：用相应的HTRF ®试剂进行细胞因子定量。

将细胞从每孔1,562个细胞到100,000个细胞铺板于96孔板，用10 µg/mL 的LPS 刺激细胞，诱导细胞生成IL1β、IL6、TNFα。

然后，用1ng/mL 聚丙烯酸甲酯（PMA ）和500 ng/mL 伊屋诺霉素与细胞共培养，刺激产生IFNγ。

细胞刺激在37°C 进行，并过夜。

在基于细胞的检测过程中，加入100 µl 氟化钾（KF ）后读数。

在基于上清液的检测过程中，转移50µl 细胞上清液到检测板中，与HTRF ®抗体孵育一段时间后读数。

数据显示在相应的细胞密度条件下，细胞和上清液两种方法检测得到的细胞因子浓度相近，表明细胞的存在不会改变检测性能。

当每孔超出
6,250个细胞时，浓度超出检测范围，无法对IL6水平（Panel D ）进行定量。

图5. HTFR 细胞因子检测
订购信息
细胞因子检测试剂盒
补充产品
炎症因子检测
背景简介
炎症因子是指在炎症中起介质作用的物质，包括组胺、缓激肽、PGE2、PGD2、LTB4、LTC4、LTD4、粘附分子、趋化因子等。

Cisbio利用HTRF技术，提供快速、简单的炎症因子检测方案，目前包括PGE2、LTB4、LTC4和组胺。

11
前列腺素（prostaglandin，PG）和白三烯（leukotrienes，LT）均由花生四烯酸衍生而来。

磷脂酶A（PLA）分解膜磷脂产生花生四烯酸，经环氧化酶（COX-1或COX-2）途径产生前列腺素，通过脂氧合酶途径合成白三烯（见图6）。

花生四烯酸在两种环氧酶（COX-1、COX-2）的作用下形成PGG2和PGH2，再在至少三种PGE2合酶（PGES-1、PGES-2、PGES-3）催化下产生PGE2（如图6所示）。

PGE2在肿瘤、炎症、血压调节中发挥着重要作用。

PGE2有EP1、EP2、EP3和EP4四个亚型的受体，均为G 蛋白偶联的细胞膜受体。

这4种受体功能相互拮抗，EP1受体通过提高细胞内Ca2+和激活蛋白激酶C而发挥作用，EP3受体激活后抑制腺苷酸环化酶的活性，而EP2和EP4受体主要通过激活腺苷酸环化酶，从而活化蛋白激酶A，使糖原合成激酶-3磷酸化失活而发挥效应。

5-脂氧合酶催化花生四烯酸代谢为氧化二十碳烯酸（5-HPETE），经脱水酶迅速转变为不稳定的环氧化物LTA4，再在水解酶或谷胱甘肽-5-转移酶的作用下，转变为二羟酸白三烯B4（LTB4）。

LTA4在白三烯C4合成酶作用下与谷胱甘肽结合生成白三烯C4（LTC4）。

白三烯是炎症反应中的一种重要物质，是某些变态反应、炎症以及心血管等疾病中的化学介质。

白三烯及其类似物阻断剂的研究，对于免疫以及发炎、过敏的治疗都有重要意义。

图6. PGE2、LTB4、LTC4的合成途径
PGE2是检测药物调节COX-1和COX-2和前列腺素合成酶作用的常用方法。

LTB4和LTC4可分
别用于确定白三烯A4水解酶和白三烯C4合成酶的活性。

组胺是一种小分子生物胺，在介导速发型过敏反应和炎症反应以及几种特应性疾病如过敏性鼻炎、支气管哮喘和湿疹等疾病中有着重要作用。

组胺在体内由组氨酸在组氨酸脱羧酶的作用下脱羧基而成，组织中的组胺是以无活性的结合型存在于肥大细胞和嗜碱性粒细胞的颗粒中，以皮肤、支气管粘膜、肠粘膜和神经系统中含量较多。

当机体受到理化刺激或发生过敏反应时，可引起这些
12
细胞的细胞膜通透性改变，释放组胺，与靶细胞膜上的组胺受体结合而产生生物效应。

如小动脉、小静脉和毛细血管舒张，引起血压下降甚至休克；增加心率和心肌收缩力，抑制房室传导；兴奋平滑肌，引起支气管痉挛，胃肠绞痛；刺激胃壁细胞，引起胃酸分泌。

组胺受体有H1、H2、H3亚型。

组胺的临床应用已逐渐减少，但其受体阻断药在临床上却有重大价值。

产品特点
∙可进行细胞、细胞上清液检测和生化检测。

∙操作过程简单、快速
∙检测范围高
∙Z'值高
∙可以微型化到10 µL体系，适用于自动化操作和高通量筛选（HTS）
∙不会与PGH2和PGF2产生交叉反应
产品应用
∙PGE2用于检测化合物对COX-2和前列腺素合成酶的调节
∙LTB4和LTC4可分别用于检测白三烯A4水解酶和白三烯C4合成酶的活性
∙组胺试剂盒可对组胺进行定量检测，进行过敏和哮喘评估
实验原理
HTRF®PGE2，LTB4和LTC4检测都是基于HTRF技术的竞争性免疫反应。

以PEG2为例，使用d2标记的PGE2和铕穴状化合物（Eu3+ Cryptate）标记的PGE2抗体，样品中的游离PEG2与d2标记PEG2竞争铕标记的PEG2抗体的抗原结合位点（图7）。

当铕标记的PEG2抗体与
d2标记的PEG2结合后，会发生能量共振转移，从而产生荧光信号。

样品中的游离PEG2越多，游离的PEG2与抗体结合越多，荧光信号越小。

图7. HTRF® PGE2检测原理
13
HTRF®组胺检测也是基于免疫竞争法原理，使用XL665标记的组胺和穴状化合物标记的组胺抗体，样品中的组胺与XL665标记的组胺竞争结合穴状化合物标记的组胺抗体（见图8）。

样品中的组
胺含量与HTRF信号呈反比。

图8. HTRF®组胺检测原理
实验过程
PEG2、LTB4和LTC4的检测过程为，在细胞刺激孵育后，只需要进行加入HTRF检测试剂孵育一段时间即可读数（图9）。

图9. HTRF® PGE2检测过程
组胺检测过程与PEG2、LTB4和LTC4检测稍有不同，组胺检测需要乙酰化，乙酰化和检测可以
在同一块板子中同时进行（见图10），容易实现自动化操作。

检测过程包括两步：第一步：乙酰化
第二步：加入HTRF®试剂检测组胺
14
图10.HTRF®组胺检测过程
产品性能
应用实例
PGE2检测
HTRF® PGE2检测试剂盒的一个优点是，在细胞存在的情况下不会降低分析性能。

将U937细胞
与10nM豆蔻酰佛波醇乙酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）一起培养48小时，然后
将细胞以1,105个细胞/孔/100 µl与10 µg/ml的脂多糖（LPS）以及不同浓度的吲哚美辛一起加
入微孔板中。

PGE2检测试剂可以直接加入细胞中，或者转移50 µl细胞上清液到新的微孔板中，然后加入检测试剂，室温孵育4小时后，在620nm和665nm处分别读取信号。

结果如图11所示，基于细胞的检测与上清液检测，两者的结果没有显著差异。

加入吲哚美辛（PGE2产生的抑
制剂），刺激单核细胞产生PGE2，HTRF检测得到吲哚美辛IC50（1.0 ± 0.4 nM），与之前发表
的数据一致（Palomer A. et al. 3 ± 2 nM ; Chan C.C. et al. 7 ± 1 nM）。

15
图11.基于细胞与上清液的HTRF PEG2检测，两者结果一致
组胺检测
大鼠嗜碱粒细胞（RBL-2H3），分别在含2.5 µM钙离子载体（ionomycin）和无钙离子载体条件下共培养，37ºC刺激细胞30分钟后用HTRF®的释放。

在细胞裂解液中测定总的组胺含量，在只用培养基培养细胞中检测细胞自发释放的组胺含量。

结果如图12所示。

图12.大鼠嗜碱粒细胞的组胺释放研究
相似的研究在人外周血嗜碱粒细胞中进行（图13）。

将钙离子载体得到的组胺非特异性释放，与用膜结合的IgE与抗IgE抗体交联诱导的特异性脱粒进行比较。

误差线表示3次重复的标准差。

（来自Claret et al. Comb Chem & High Throughput Screening. 2003;6:789-94.）
16
图13. 外周血嗜碱粒细胞的组胺释放研究订购信息
补充产品
17
18
代谢疾病研究检测试剂
HTRF ®皮质醇检测 皮质醇（Cortisol ）简介
皮质醇（MW 362.5），也可称为“可的松”或“氢化可的松”，是由肾上腺在应激反应中分泌产生的主要糖皮质激素，在血液中以游离形式存在或者与皮质醇结合蛋白（cortisol binding protein ，CBG ）结合，主要的功能包括调节糖代谢、脂肪代谢、血压以及压力抑制等。

皮质醇也可以进入细胞，其水平主要由11β-羟类固醇脱氢酶1型或2型（11β-HSD1或11β-HSD2）调节（见图14）。

11β-HSD1是NADP （H ）依赖的双向调节酶，受NADPH 与NADP 比值的调节，在不同环境下能双向调节氢化皮质醇与皮质醇之间的转换，即有脱氢和还原双向作用。

而11β-HSD2只能单向催化底物的脱
氢，使氢化皮质醇转化为皮质醇。

虽然11β-HSD1在体外是一个可逆的氧化还原酶，但越来越多的研究表明其在体内主
要起还原酶的作用，使局部无活性的11-酮类固醇转变成有活性的糖皮质激素。

实验原理和检测过程
HTRF ®皮质醇检测是基于单克隆抗体的竞争性免疫测定。

d2标记的皮质醇和样品中游离的皮质醇同时竞争Eu 3+穴状化合物标记的皮质醇抗体的结合位点（见图15）。

当样品中游离的皮质醇含量越高时，d2-皮质醇与抗体结合的越少，因而HTRF ®信号越小，反之，当样品中的皮质醇含量越低时，HTRF 信号越强。

HTRF 信号与样品中皮质醇的含量呈反比。

图15. HTRF ®
皮质醇检测原理
产品特点
∙ 可检测复杂样品如血清和全细胞 ∙ 可进行细胞和生化检测
图14. 皮质醇和氢化皮质醇之间的转
化由11β-HSD 调节。