不同酿酒酵母发酵对红葡萄酒中花色苷组成的影响

不同酿酒酵母发酵对红葡萄酒中花色苷组成的影响
李双石;苏宁;吴志明;李淳;兰蓉
【摘要】To explore wild yeast resources in China, the anthocyanin composition and content in the red wines fermented by different Saccharomyces cerevisiae strains were compared. Two different Saccharomyces cerevisiae strains (indigenous Saccharomyces cerevisiae strain Y17, commercial active dry yeast F15) were separately used in red wines production. The anthocyanin components in wines were studied by high performance liquid chromatography-mass spec- trometry (HPLC-MS). The results showed that the diversities of anthocyanins in the wines fermented by different yeast strains were similar, but the contents of different anthocyanins in the wines were quite different. The indigenous yeast strain Y17 produced wines with higher concentrations of anthocyanins.%比较了不同酿酒酵母菌株发酵对红葡萄酒中花色苷组分的影响,为本土酵母的开发应用提供依据。

采用本土自筛酿酒酵母菌株Y17和进口商业酵母菌株F15分别酿造干红葡萄酒,并利用高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）对葡萄酒中的花色苷成分进行检测。

结果表明,不同酵母发酵葡萄酒中的花色苷成分种类大体相同,但各种花色苷的含量具有较大差别,本土酵母菌株Y17在发酵生产高花色苷含量葡萄酒方面具有优势。

【期刊名称】《食品与发酵工业》
【年(卷),期】2012(038)011
【总页数】4页(P101-104)
【关键词】红葡萄酒;酿酒酵母;花色苷;高效液相色谱-质谱技术（HPLC-MS）【作者】李双石;苏宁;吴志明;李淳;兰蓉
【作者单位】北京电子科技职业学院,北京100029;中粮华夏长城葡萄酒有限公司,河北昌黎066600;北京电子科技职业学院,北京100029;北京电子科技职业学院,北京100029;北京电子科技职业学院,北京100029
【正文语种】中文
【中图分类】TS262.6
葡萄酒中的花色苷是赋予酒体颜色的主要化合物，其存在的形态及含量直接影响葡萄酒的色度、色调及稳定性［1］。

花色苷类物质不仅为葡萄酒提供颜色，还对葡萄酒的感官品质，如色泽、苦味、收敛性、稳定性和澄清度等都起着重要的作用［2］。

此外，它还具有多种生理活性作用，如清除体内自由基和抗氧化作用，抑制低密度脂蛋白氧化和血小板聚集，预防冠心病、高血脂、动脉粥样硬化及白内障等疾病［3］。

目前对葡萄酒中花色苷生成影响因素的研究报道较多，但关于酿酒酵母对葡萄酒花色苷成分影响的报道却较少，尤其是本地自筛酵母对葡萄酒花色苷成分的影响还未见报道。

王琨等人研究发现，在葡萄酒生产过程中使用不同商业酵母会使葡萄酒的颜色有一定的差别，进而影响葡萄酒的外观品质［4］。

Morata等人研究认为，在生产中选择不同酵母对葡萄酒中的花色苷会有着不同程度的影响，其主要原因之一是酵母的细胞壁对花色苷的吸附作用，这也是酿酒酵母影响葡萄酒外观品质的主要机理［5－6］。

本研究利用 HPLC-MS技术［7］对不同酿酒酵母发酵的酒样进行花色苷成分的测
定，分析不同酿酒酵母菌株发酵对葡萄酒中花色苷含量与组成的影响，同时也为本土自筛酵母的开发应用提供了依据。

1 材料与方法
1.1 供试菌株
本土自筛酿酒酵母Y17，分离自河北产区赤霞珠葡萄(Cabrnet Sauvignon)的自然发酵液中，现保藏于中国农业大学食品学院;对照商业酵母F15是进口商业活性干酵母Zymaflora F15，购自法国LAFFORT公司。

1.2 试剂
乙腈和甲酸均为色谱纯，购于Fisher公司;标品为二甲基花翠素-3-葡萄糖苷(Malvin-3-O-glucoside)购自法国Extrasynthese SA公司。

1.3 仪器
300L干红葡萄酒不锈钢发酵罐，山东中德设备有限公司;Agilent 1100系列
LC/MSD Trap-VL液相色谱-离子阱质谱联用仪，美国安捷伦公司。

液相色谱部分包括G1379A在线真空溶剂脱气机、G1311A四元高压梯度泵、G1313A自动进样器、G1316A柱温箱、G1315A二级管阵列检测器;质谱部分包括电喷雾离子源和离子阱质谱检测器;控制软件为安捷伦v5.2化学工作站。

1.4 实验方法
1.4.1 葡萄酒酿造实验
2011年10月初从河北沙城产区采摘成熟的赤霞珠葡萄，葡萄除梗破碎，装入发酵罐中。

在葡萄汁中加入亚硫酸，使其SO2含量达到60mg/L，同时添加40 mg/L果胶酶，添加辅料后，混合均匀。

本土酵母菌株Y17活化后按3%的接种量接种至发酵罐，对照酵母F15依产品说明书活化接种。

酵母接种后每日监控发酵温度和发酵液比重，需控制发酵温度在25～28℃。

酒精发酵结束后，对葡萄酒样进行取样，－20℃低温保存，待进一步进行成分分析。

1.4.2 葡萄酒样花色苷成分分析
将葡萄酒样经0.45 μm水系膜过滤，利用HPLCMS检测酒样的花色苷成分。

具体条件:色谱柱:Zorbax C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:A 液为5.0% 的甲酸水溶液;流动相B为5% 的甲酸乙腈溶液;进样量20μL;流速1.0 mL/min;柱温25℃;检测波长 525 nm。

洗脱程序:0～1 min，3%B;1～12 min，3 ～15%B;12 ～24 min，15 ～25%B;24 ～28 min，25～30%B;28～32 min，30～4%B。

质谱条件:电喷雾离子源(ESI)，正离子模式，离子扫描范围为100～1500 m/z;雾化器压力30psi;干燥气流速度12 L/min;干燥气温度300℃;CID的MS/MS诱导碰撞电压1.0V。

花色苷定性分析方法:参照文献［8］建立的“葡萄与葡萄酒花色苷HPLC-UV-MS 指纹谱库”，通过对样品图谱中的质谱信息和保留时间与谱库进行对比分析，进而确定样品中各种花色苷的种类和结构。

花色苷定量分析方法:参照文献［8］对葡萄酒样品中的各种花色苷进行定量分析，以二甲花翠素-3-葡萄糖苷为外标定量，其它花色苷的含量均以相当于二甲花翠素-3-葡萄糖苷的含量表示。

2 结果与分析
2.1 不同酵母对花色苷含量的影响
应用HPLC-MS技术对不同酵母发酵酒样进行花色苷的测定，共检测出24种花色苷类物质，见表1所示。

由结果可知，不同酵母酿造的葡萄酒的花色苷种类并没有差别，但在含量上则存在着较大的差异。

其中，以3'5'-二甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷及其乙酰化的葡萄糖苷的含量最高，不同酵母发酵的酒中这2种花色苷含量之和都占到了花色苷总量的50%以上。

从花色苷的总量上来分析，本土自筛酵母Y17发酵的酒样中花色苷的含量高达693.13 mg/L，显著高于国外商业酵母
F15发酵的酒样，其花色苷的总量仅为491.82 mg/L。

除3'5'-甲基花翠素-3-O-
葡萄糖苷-4-乙烯基苯酚之外，其余23种花色苷在Y17发酵酒中的含量均显著高于F15发酵的酒样。

表1 不同酵母发酵结束后花色苷的含量序号花色苷名称花色苷含量/(mg·L－1)F15 Y17基本花色苷1 malvidin-3-O-glucoside 3'5'-二甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷214.41 268.86 2 dephinidin-3-O-glucoside 花翠素-3-O-葡萄糖苷 23.83 34.57 3 petunidin-3-O-glucoside 3'-甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷 23.54 37.76 4 peonidin-3-O-glucoside 3'-甲基花青素-3-O-葡萄糖苷 10.39 20.76 5 malvidin-3，5-diglucoside 3'5'-二甲基花翠素-3，5-二葡萄糖苷 6.08 10.73 6 cyanidin-3-O-glucoside 花青素-3-O-葡萄糖苷 3.74 6.69酰化花色苷7 malvidin-3-O-(6-O-acetyl)-glucoside 3'5'-甲基花翠素-3-O-(6-O-乙酰化)-葡萄糖苷 109.20 128.14 8 malvidin-3-O-(trans-6-O-coumaryl)-glucoside 3'5'-甲基花翠素-3-O-(6-O-反式香豆酰化)-葡萄糖苷 25.08 31.15 9 dephinidin-3-O-(6-O-acetyl)-glucoside 花翠素-3-O-(6-O-乙酰化)-葡萄糖苷 12.60 25.58 10 peonidin-3-O-(6-O-acetyl)-glucoside 3'-甲基花翠素-3-O-(6-O-香豆酰化)-葡萄糖苷 10.09 14.80 11 peonidin-3-O-(6-O-acetyl)-glucoside 3'-甲基花翠素-3-O-(6-O-乙酰化)-葡萄糖苷 9.76 15.83 12 cyanidin-3-O-(6-O-acetyl)-glucoside 花青素-3-O-(6-O-乙酰化)-葡萄糖苷 3.81 8.32 13 peonidin-3-O-(trans-6-O-coumaryl)-glucoside 3'-甲基花青素-3-O-(6-O-反式香豆酰化)-葡萄糖苷 3.68 5.82 14 cyanidin-3-O-(6-O-coumaryl)-glucoside 花青素-3-O-(6-
O-香豆酰化)-葡萄糖苷 1.86 8.27 15 malvidin-3-O-(cis-6-O-coumaryl)-glucoside 3'5'-甲基花翠素-3-O-(6-O-顺式香豆酰化)-葡萄糖苷 2.68 4.73 16 petunidin-3-O-(6-O-coumaryl)-glucoside 3'-甲基花翠素-3-O-(6-O-香豆酰化)-葡萄糖苷 1.78 5.44聚合花色苷17 malvidin-3-O-glucoside-pyruvic acid 3'5'-甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷-丙酮酸 5.47 18.64 18 malvidin-3-O-(6-O-
acetyl)-glucoside-pyruvic acid 3'5'-甲基花翠素-3-O-(6-O-乙酰化)-葡萄糖苷-丙酮酸 5.00 12.48 19 malvidin-3-O-(6-O-acetyl)-glucoside-acetaldehyde
3'5'-甲基花翠素-3-O-(6-O-香豆酰化)-葡萄糖苷-乙醛 5.00 11.60 20 malvidin-3-O-glucoside-4-vinylphenol 3'5'-甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷-4-乙烯基苯酚3.61 2.75 21 malvidin-3-O-(6-O-acetyl)-glucoside-4-vinylphenol 3'5'-甲基花翠素-3-O-(6-O-乙酰化)-葡萄糖苷-4-乙烯基苯酚 3.35 4.48 22 malvidin-3-O-glucoside-acetaldehyde 3'5'-甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷-乙醛 2.82 6.41 23 malvidin-3-O-(6-O-coumaryl)-glucoside-acetaldehyde 3'5'-甲基花翠素-3-O-(6-O-香豆酰化)-葡萄糖苷-乙醛 2.04 5.45 24 malvidin-3-O-(6-O-coumaryl)-glucoside-4-vinylphenol 3'5'-甲基花翠素-3-O-(6-O-香豆酰化)-葡萄糖苷-4-乙烯基苯酚1.99 3.87
2.2 不同酵母对花色苷组成的影响
葡萄酒的颜色不仅与花色苷的含量有关，还和花色苷的种类有关系［9－10］。

根据花色苷的结构，可以将花色苷分为基本花色苷(非酰化花色苷)、酰化花色苷和聚合花色苷［10］。

由表1可知，不同酵母发酵的葡萄酒中花色苷的种类繁多，其中含6种基本花色苷、10种酰化花色苷和6种聚合花色苷。

本土酵母Y17和商业酵母F15发酵的葡萄酒中不同类型花色苷的含量差异如图1所示。

由结果可知，在刚刚发酵完的葡萄酒中，含量最多的花色苷类型为基本花色苷，其次为酰化花色苷，此外还有少量花色苷会和发酵过程产生的小分子物质如丙酮酸、乙醛等物质结合生成聚合花色苷，这使葡萄酒中的花色苷的组成更加复杂。

葡萄酒在酿造过程中伴随着某些花色苷的消失和生成，这些变化可能是由于各种花色苷在浸渍过程中浸出速率的不同、部分花色苷的降解或聚合以及酵母细胞壁对花色苷的吸附能力不同等原因造成的。

Morata等人研究发现，在发酵过程中，酵母细胞壁对酰化花色苷的吸附作用要强于非酰化花色苷。

而对于酵母细胞壁吸附的花
色苷含量而言，不同酵母株系之间也有着很大的差异［6］。

性能优良的酿酒酵母要能够为葡萄酒提供更多的花色苷。

由图1可知本土酵母Y17发酵葡萄酒中各种
类型花色苷的含量都显著高于商业酵母F15发酵的葡萄酒样，Y17在发酵生产高
花色苷含量葡萄酒方面具有明显优势。

图1 不同酵母发酵酒样中不同类型花色苷含量对比
2.2.1 基本花色苷(非酰化花色苷)
不同酵母发酵葡萄酒中的基本花色苷有5种，即花翠素-3-O-葡萄糖苷、花青素-
3-O-葡萄糖苷、3'-甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷、3'-甲基花青素-3-O-葡萄糖苷和
3'5'-二甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷。

这些基本花色苷是欧亚种葡萄和葡萄酒中共有的花色苷，同时，也是其它花色苷的前体［10］。

其中，花翠素是最不稳定的，
而二甲花翠素则最为稳定［11］。

除此之外，不同葡萄酒样中还含有3'5'-二甲基花翠素-3，5-二葡萄糖苷。

双糖苷花色素较单糖苷类型更易发生褐变，从而影响
葡萄酒的色调［12］。

从基本花色苷的总量上来分析，本土酵母Y17发酵酒样中基本花色苷的含量高达379.37 mg/L，显著高于国外商业酵母F15发酵的酒样，其花色苷的总量仅为281.99 mg/L。

其中Y17发酵酒样中3'-甲基花青素-3-O-葡萄糖苷的含量将近是
F15发酵酒样中含量的2倍。

2.2.2 酰化花色苷
葡萄酒中的酰化花色苷主要来源于葡萄，它们是上述基本花色苷乙酰化、香豆酰化、咖啡酰化、阿巍酰化等酰基化修饰的花色苷，这些修饰反应可影响着花色苷的稳定性和颜色表现［12］。

本研究在不同酵母发酵的葡萄酒样中，共检测到10种酰化花色苷，其中乙酰化花色苷4种，香豆酰化花色苷6种。

乙酰化修饰能够大大增
加花色苷在水溶液中的稳定性，香豆酰化修饰可以使花色苷的色调偏蓝。

由结果可知，不同酵母发酵的酒样中不同种类酰化花色苷的比例结构非常相似，即乙酰化花
色苷约占酰化花色苷的71%～75%，香豆酰化花色苷约占酰化花色苷的25% ～29%。

Han等人研究发现，酰化的花色苷对颜色的贡献大于非酰化花色苷，香豆
酰化的花色苷对颜色的贡献又大于乙酰化花色苷，并且顺式香豆酰化花色苷的贡献大于其反式的贡献［9］。

由此可见，进一步提高葡萄酒中酰化花色苷的含量，有利于葡萄酒颜色的增强和稳定。

由表1可知，本土酵母Y17发酵酒样中乙酰化花
色苷的含量高达177.88 mg/L，而在F15发酵酒样中的含量仅为135.37 mg/L。

香豆酰化花色苷的含量在Y17和F15发酵酒样中的含量分别为70.21 mg/L和45.17 mg/L。

2.2.3 聚合花色苷
由表1可知，不同酵母发酵葡萄酒中的聚合花色苷均为吡喃型花色苷，即基本花
色苷和它们相应的酰化花色苷与乙醛、丙酮酸、4-乙烯基苯酚等化合物反应形成
一个新的吡喃环化合物。

吡喃型花色苷在葡萄果实中不存在，主要是在发酵过程中通过花色苷与酵母代谢产物间的反应形成的［6］。

因此，新鲜葡萄酒中聚合花色苷组成的分布受酵母影响较大。

本研究结果表明，Y17发酵酒样中聚合花色苷的
含量高达65.67 mg/L，显著高于F15发酵酒样中聚合花色苷的总量(29.29 mg/L)。

聚合花色苷与游离花色苷相比，受pH值和SO2的影响较小，稳定性较高［13］。

吡喃型花色苷可能对葡萄酒橙红色的贡献更大［10］。

3 结论
本研究采用本土自筛酿酒酵母菌株Y17和国外商业酿酒酵母F15酿造干红葡萄酒，利用HPLC-MS技术测定葡萄酒中花色苷的含量与组成。

结果表明，不同酵母发
酵葡萄酒中的花色苷成分种类没有差别，共检测出24种花色苷类物质，其中，以
3'5'-二甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷和3'5'-甲基花翠素-3-O-(6-O-乙酰化)-葡萄糖
苷的含量最高。

不同酵母发酵葡萄酒中的花色苷含量具有较大差别。

本土酵母菌株Y17发酵酒样中花色苷的总量和绝大多数类型花色苷的含量均显著高于商业酵母
F15发酵的酒样，Y17在发酵生产高花色苷含量的葡萄酒能力方面具有优势，因此，此菌株具有生产本地特色葡萄酒的潜质。

参考文献
［1］杜文华，刘忠义.葡萄酒中花色苷的研究进展［J］．食品与机械，2011，
27(4):169 －176.
［2］ Vidal S，Francis，Noble A，et al.Taste and mouth-feel properties of different types of tannin-like polyphenolic compounds and anthocyanins
in wine［J］．Analytica Chimica Acta，2004，513(1):57 －65.
［3］王璐，王振宇，李小雨.花色苷的分离鉴定及生物活性综述［J］．食品工业
科技，2012，33(3):395－399.
［4］于庆泉.蛇龙珠红葡萄酒酿造过程中花色苷的变化规律研究［D］．北京:中
国农业大学，2006.
［5］ Morata A，Gómez-Cordovés MC，Suberviola G，et al.Adsorption of anthocyanins by yeast cell walls during the fermentation of red wines ［J］．Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003，51:4 084 －4 088.
［6］ Morata A，Gómez-Cordovés MC，Suberviola G，et al.Cell wall anthocyanin adsorption by different Saccharomyces strains during the fermentation of Vitis vinifera L.cv.Graciano grapes［J］．European Food Research and Technology，2005，220(3-4):341 －346.
［7］于东，陈桂星，方忠祥，等．花色苷提取、分离纯化及鉴定的研究进展［J］．食品与发酵工业，2009，35(3):127－133.
［8］孙建平.葡萄与葡萄酒中酚类物质LC-UV-MS/MS谱库构建及应用［D］．北京:中国农业大学，2006.
［9］ Han Fu-liang，Jiang Shou-mei，He Jian-jun，et al.Anthocyanins
in‘Cabernet Gernischet’(Vitis vinifera L.cv.)aged red wine and their color in aqueous solution analyzed by partial least square regression［J］．Food Science and Biotechnology，2009，18(3):724 －731.
［10］韩富亮，李杨，李记明.红葡萄酒花色苷结构和颜色的关系研究进展［J］．食品与生物技术学报，2011，30(3):328－336.
［11］刘树文，何玲，任玉华.葡萄果实中花色素合成及其影响因素［J］．中外葡萄与葡萄酒，1999(2):79－181.
［12］秦含章．葡萄酒分析化学［M］．北京:中国轻工业出版社，1985:323－354.
［13］王华，丁刚，崔福君.葡萄酒中花色素苷研究现状［J］．中外葡萄与葡萄酒，2002(2):25－29.。