检测总RNA质量的两种方法比较研究_梁婧娴

西南民族大学学报·自然科学版第38卷第1期 Journal of Southwest University for Nationalities ⋅Natural Science Edition Jan.

2012___________________________________________________________________

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收稿日期：2011-10-26

通讯作者：徐亚欧(1957-), 男, 教授. E-mail: xuyaou@.

文章编号: 1003-2843(2012)01-0069-04 检测总RNA 质量的两种方法比较研究

梁婧娴, 陈志成, 贺庆华, 江容娥, 徐亚欧

（西南民族大学生命科学与技术学院, 成都 610041）

摘 要: 采用普通琼脂糖凝胶电泳和甲醛变性胶电泳两种方法对小鼠、藏绵羊的新鲜组织及非洲绿猴肾细胞提取的总

RNA 进行检测, 比较两种方法对总RNA 质量检测的特点. 结果显示: 甲醛变性胶对总RNA 质量检测结果明显优于普通

琼脂糖凝胶, 证明对总RNA 质量的检测更适合采用甲醛变性胶电泳法.

关键词:总RNA 质量；琼脂糖凝胶电泳；变性胶电泳

中图分类号: Q7 文献标识码：A

doi ：10.3969/j.issn.1003-2483.2012.01.15

总RNA 的提取技术是分子生物学研究的基础, 总RNA 的质量（纯度及完整性）是后续实验成功与否的前提, 因此检测总RNA 的纯度及完整性至关重要. 凝胶电泳由于其操作简便、快速、灵敏等优点, 使它成为分离、鉴定和提纯核酸的首选标准方法. 凝胶电泳分离RNA, 是通过观测泳道中28S 和18S rRNA 带型清晰程度和二者的相对亮度来确定RNA 的质量. 普通的琼脂糖凝胶[1]一般用于分离不同大小的DNA, 也有些研究人员用于检测总RNA 的质量, 本文总结了总RNA 提取及两种检测RNA 质量的方法并对其进行讨论.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验样品

用高温烘烤过的剪刀分别采取藏绵羊的真胃组织、小鼠腿肌组织；另取培养的非洲绿猴肾细胞, 迅速置于液氮中保存备用.

1.1.2 实验主要仪器及试剂

GEL DOC2000凝胶成像系统（美国BIO-RAD 公司）, WAP Biowave 核酸蛋白检测仪(英国Biochrom 公司), 高速冷冻离心机（Centrifuge 5415R, Eppendorf, Inc ）, Bio-Rad POWER PacHV 稳压电泳仪（美国BIO-RAD 公司）, 研钵等；Trizol Reagent （美国Invitrogen 公司）, 异丙醇, 氯仿, 无水乙醇, 琼脂糖（西班牙Biowest ReGular

公司）, MOPS （美国SIGMA 公司）, 甲醛, 2×RNA Loading Dye （美国Fermentas 公司）, Rnase Free dH 2O

（TaKaRa 公司）.

1.2 实验方法

提取RNA 所用的玻璃、陶瓷、金属器具经180℃烘干6h, 移液枪头、EP 管等均用DEPC 水处理并高压灭菌. 电泳槽以及其他塑料电泳设备均用双氧水浸泡过夜后, 再用DEPC 处理水冲洗, 置于超净工作台备用.

1.2.1 总RNA 提取方法

参照Trizol Reagent 说明, 用Trizol 法提取动物组织总RNA, 具体步骤如下:

先将研钵充分预冷, 取约100mg 组织样品放入已预冷的研钵中进行研磨, 边研磨, 边加液氮, 研磨组织样品至粉末状后（无明显可见颗粒）迅速将样品转移到预先加有1mLTrizol 的1.5mL 离心管中, 震荡混匀；室温静

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置5min, 4℃ 12,000rpm离心10min；将上清液转移至新的1.5mLEP管中, 加入所用Trizol1/5体积的氯仿, 用手上下颠倒混匀, 直至溶液呈乳白色；室温静置5min, 4℃下12,000rpm离心15min；将上层溶液小心转移至新的EP管中, 加入等体积的异丙醇, 上下颠倒混匀, 室温静置10min后, 4℃下12,000rpm离心10min；小心弃去上清, 向含有沉淀的离心管中缓慢加入1mL预冷的75%乙醇, 轻轻上下颠倒, 清洗沉淀, 4℃下7500rpm离心5min；弃上清, 室温干燥2min, 加入适量RNase free dH2O溶解沉淀.

提取非洲绿猴肾细胞总RNA方法如下: 取适量培养的非洲绿猴肾细胞, 离心后去除培养液；加1mL预冷的PBS洗细胞一次, 再离心后去除PBS液；加1mLTrizol到细胞沉淀EP管中, 用移液枪轻轻吹打混匀；裂解细胞后的步骤与提取动物组织总RNA方法相同.

1.2.2 核酸蛋白检测仪检测总RNA浓度及质量

在检测RNA质量前, 将核酸蛋白检测仪预热10min. 用与溶解RNA相同的RNase free dH2O调零, 测定RNA样品的OD值, 所有RNA样品A260/A280比值均在1.7与2.0之间, 表明RNA纯度较高、质量较好. 1.2.3 电泳检测总RNA完整性方法

(1) 普通琼脂糖凝胶用1×TBE缓冲液（pH 8.0）配制1%的琼脂糖凝胶, 加入适量GoldViewTM核酸染料. 由核酸蛋白检测仪测定RNA浓度, 计算电泳点样量: 绵羊真胃RNA约30µg, 小鼠腿肌RNA约40µg, 非洲绿猴肾细胞RNA约13µg. 点样后, 以5V/cm电泳, 当指示剂跑过胶板的1/2时, 终止电泳, 用凝胶成像系统检测.

(2) 甲醛变性胶配制1%的甲醛变性凝胶: 用14.4mL ddH2O使0.2g琼脂糖熔化后加入2mL 10×MOPS缓冲液并混合均匀, 冷却至60℃左右时在通风橱中加入3.6mL37%的甲醛, 混匀后制胶[2-5]. RNA电泳前处理: RNA 样本和2×RNA Loading Dye 等体积混合, 70℃热浴10min, 冰浴3min, 上样前短暂离心. 以5V/cm预电泳5min 后点样, 点样量与对应的普通琼脂糖凝胶的样品量相同, 然后用与预电泳时同样电压进行电泳[1], 当指示剂跑过胶板的1/2, 可终止电泳；电泳凝胶置凝胶成像仪中观察, 拍照.

2 结果与分析

2.1 电泳结果

同一RNA样品在甲醛变性胶凝胶与普通琼脂糖凝胶电泳中比较表明: 甲醛变性胶凝胶上28S rRNA和18S rRNA谱带较普通琼脂糖凝胶电泳谱带亮度高, 而5S rRNA谱带亮度较弱（图1Ａ、图2Ａ、图3Ａ）, 且28S rRNA 谱带亮度是18S rRNA谱带亮度的2倍左右, 说明被检测的总RNA完整性较好；但同样的组织样品提取的RNA 在普通琼脂糖凝胶电泳中成像上显示, 28S rRNA和18S rRNA谱带很淡, 5SrRNA谱带则亮度较高（图1B、图2B）. 在普通琼脂糖凝胶电泳鉴定从非洲绿猴肾细胞中提取的RNA时显示与甲醛变性胶凝胶检测的结果一致（图3A、3Ｂ）. 提示, 细胞RNA的提取过程对RNA的破坏比提取组织RNA要少, 细胞RNA与组织RNA的稳定性、空间结构可能有所不同.

图1藏绵羊真胃组织RNA 图2 小鼠腿肌组织RNA 图3 非洲绿猴肾细胞RNA

注: A. 变性胶 B. 非变性胶注: A. 变性胶 B. 非变性胶注: A. 变性胶 B. 非变性胶