基础医学核酸疫苗及免疫研究进展
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Diagram
1 2 3 4 核酸疫苗的发展史
核酸疫苗定义
核酸疫苗的构建 核酸疫苗的作用原理 核酸疫苗的优缺点和应用现状
5
疫苗是将病原微生物（如细菌、立克次氏体、病 毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工
程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。 人们将多种灭活或减毒疫苗称为第一代疫苗。 将用基因工程的方法研制的亚单位疫苗称为第二 代疫苗。 理想疫苗应具备的特征有：安全、廉价、热稳定 性好，含有多种具有保护作用的免疫原，最好是一次口服 即可生效。目前前两代均不能满足上述标准。故基因疫苗 应运而生。
基因疫苗被称为第三代疫苗。
1990年wolff等从事于基因治疗工作时，用 外源性重组质粒给小鼠肌肉注射后，质粒 被摄取并能在体内至少两个月稳定地表达 所编码蛋白。 1991年Williams等发现外源基因输入体内 的表达产物可诱导产生免疫应答。 1992年Tang等将表达人生长激素的基因质 粒DNA导入小鼠皮内，小鼠产生特异性抗体， 从而提出了基因免疫的概念。 1993年Ulmer等将注射技术用于研究流感核
关于核酸免疫的国际会议
1994年5月17-18日，瑞士日内瓦。 WHO主办。主题：核酸疫苗。 1995年2月16-17日，美国马里兰州， Bethesda（NIH）。主题：基因疫苗 和核酸疫苗战略。 1995年4月6-9日，美国弗吉尼亚州。 主题：DNA疫苗：疫苗学的新时代。 1996年2月5-8日，美国马里兰州NIH Natcher会议中心。主题：核酸疫苗
定义
核酸疫苗(nucleic acid vaccine),也称 基因疫苗(genetic vaccine),是指一类将抗原
基因重组到表达载体上的重组质粒疫苗，经肌
肉注射或黏膜免疫等方法导入宿主体内，通过 宿主细胞表达抗原蛋白，诱导宿主细胞产生对 该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾 病的目的。
基因疫苗的构建 基因疫苗构建的基本途径
基因疫苗的构建
一、构建基因疫苗的载体
载体是将抗原基因导入到机体细胞的必要工
具。
1.载体的分类
按照载体功能可分为克隆载体和表达载体；
按照载体来源可分为质粒、噬菌体、黏粒和
病毒载体等。 2.常用于构建基因疫苗的载体
基因疫苗的构建 二、基因疫苗的构建方法
1.抗原基因和载体的制备
获得需要的目的基因常用的方法：
（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基
因组DNA文库(genomic DNA library)，从
中调用目的基因；
（2）以mRNA为模板，反转录合成互补的
DNA片段，建立cDNA文库； （3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性
基因疫苗的构建
基因表达载体的组成： 为了保证抗原基因 的定向正确插入，只有 以正确的方向插入表达 载体读框启动子下游才 能表达抗原基因，故抗 原基因两端应具有不同 的酶切位点，在设计时 须注意这点。 复制原点+启动子+目的基因+终止子+标记基因
2.抗原基因与载体的连接
连接的方式可分 为粘性末端连接和平末 端连接两种，其中前者 连接效率较高，使用比 较多。连接反应时应考 虑反应体积、抗原基因 与载体的比例、温度和 时间和酶量。
粘性末端连接
质粒 目的基因 用同一种或两种 限制性内切酶酶切
DNA连接酶
重组质粒
本法适用于在 质粒和目的基 因上有相同单 或双酶切位点
平末端连接
质粒
产生平末端的 内切酶
核酸酶S1 目的基因 DNA连接酶
重组质粒
本法适用于在质粒 和目的基因上没有 相同的酶切位点！
基因疫苗的构建 3.重组质粒转化受体菌
转化：将质粒或者以它为载体构建的 重组子导入细菌的过程。 转染：将质粒或者以它为载体构建的 重组子导入真核细胞的过程。 感受态：细菌经过CaCl2溶液处理和 短暂热激后，容易摄入外源DNA，这种状态 称为感受态。其原理是细菌处于0℃、低渗 CaCl2溶液中时，细胞壁和细胞膜通透性增 加。此时转化混合物中的DNA形成抗DNase
基因疫苗的构建
4.重组质粒的筛选与鉴定
一般重组质粒鉴定主要按照表型筛 选、酶切鉴定和测序鉴定的顺序进行 （1）插入片段鉴定：酶切鉴定；PCR鉴定。 （2）插入片段方向性鉴定：可利用联合酶切 方案进行目的基因的插入方向鉴定。 （3）DNA序列测定：末端终止法测序；自动 测序仪测序
基因疫苗的构建
三、重组质粒在真核细胞中的表达与检测 1.重组质粒导入真核细胞的方法 磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、脂质体 介导等方法都可以用来将外源质粒导入真 核细胞，其中脂质体介导容易成功，是最 常用的方法。 2.抗原基因在真核细胞中表达的检测 （1）蛋白水平的检测：免疫沉淀法检测表达
由于这个过程实际上是相当 复杂的，所以人们对一些具体的 细节并不清楚。下面通过对基因 疫苗经过肌肉组织和黏膜免疫的 抗原呈递途径来说明基因疫苗的 工作原理。
基因疫苗经黏膜和皮肤组织免疫的抗原 呈递 皮肤或者黏膜是具有高水平免
疫监视系统的组织，黏膜淋巴组织的 功能：参与粘膜局部免疫应答和产生 分泌型IgA。而且在免疫动物时比较 方便，尤其是大面积预防时，所以关 于基因疫苗通过皮肤或黏膜免疫激活 机体免疫反应机制的研究也比较活跃。 基因疫苗经过黏膜和皮肤组
（1）直接免疫
旅美中国科学家范泓然用皮 肤涂抹法给小鼠接种乙肝疫苗取得成 功，且检测其效果可以和所用的肌肉 注射相媲美。黏膜淋巴结提供了浆细 胞抗体型转化与Th0细胞向Th2细胞定 向分化的微环境。基因疫苗经过黏膜
免疫可以很好地激活B细胞分泌IgA，
（2）用重组减毒胞内菌系统 采用志贺氏菌、沙门氏菌或李斯特 菌等重组减毒胞内菌系统，通过粘膜自然感 染途径运送 DNA 疫苗是一类很好的方法。 因为它们可以将基因疫苗直接呈送给 APCs ， 所以这种方法运送效率高、免疫方法简单、 免疫效果好，能同时激活粘膜免疫和全身免 疫，并可获得对载体菌的免疫等优点。 减毒沙门氏菌通过自然感染的方式 高效地将基因疫苗直接运送给体内的抗原提
携带基因疫苗重组减毒沙门氏菌诱发机体免疫应答 的机制 重组减毒沙门氏菌携带的基因疫苗激发机 体的细胞免疫和体液免疫的机制还不完 全清楚。 可能途径一：DCs 和巨噬细胞吞噬侵入肠 粘膜屏障的重组沙门氏菌并被激活，活化 的 DCs 和巨噬细胞迁移到脾脏等淋巴组 织（DCs 具有很强的迁移能力，而巨噬细 胞尚有一些疑问），载体菌在此裂解，基 因疫苗进入胞液，然后进入细胞核，最后 表达目的抗原。接着激活特异的 CTL ， 裂解表达抗原的 APCs ， APCs 内的抗原
1 2 3 4 核酸疫苗的发展史
核酸疫苗定义
核酸疫苗的构建 核酸疫苗的作用原理 核酸疫苗的优缺点和应用现状
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疫苗是将病原微生物（如细菌、立克次氏体、病 毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工
程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。 人们将多种灭活或减毒疫苗称为第一代疫苗。 将用基因工程的方法研制的亚单位疫苗称为第二 代疫苗。 理想疫苗应具备的特征有：安全、廉价、热稳定 性好，含有多种具有保护作用的免疫原，最好是一次口服 即可生效。目前前两代均不能满足上述标准。故基因疫苗 应运而生。
基因疫苗被称为第三代疫苗。
1990年wolff等从事于基因治疗工作时，用 外源性重组质粒给小鼠肌肉注射后，质粒 被摄取并能在体内至少两个月稳定地表达 所编码蛋白。 1991年Williams等发现外源基因输入体内 的表达产物可诱导产生免疫应答。 1992年Tang等将表达人生长激素的基因质 粒DNA导入小鼠皮内，小鼠产生特异性抗体， 从而提出了基因免疫的概念。 1993年Ulmer等将注射技术用于研究流感核
关于核酸免疫的国际会议
1994年5月17-18日，瑞士日内瓦。 WHO主办。主题：核酸疫苗。 1995年2月16-17日，美国马里兰州， Bethesda（NIH）。主题：基因疫苗 和核酸疫苗战略。 1995年4月6-9日，美国弗吉尼亚州。 主题：DNA疫苗：疫苗学的新时代。 1996年2月5-8日，美国马里兰州NIH Natcher会议中心。主题：核酸疫苗
定义
核酸疫苗(nucleic acid vaccine),也称 基因疫苗(genetic vaccine),是指一类将抗原
基因重组到表达载体上的重组质粒疫苗，经肌
肉注射或黏膜免疫等方法导入宿主体内，通过 宿主细胞表达抗原蛋白，诱导宿主细胞产生对 该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾 病的目的。
基因疫苗的构建 基因疫苗构建的基本途径
基因疫苗的构建
一、构建基因疫苗的载体
载体是将抗原基因导入到机体细胞的必要工
具。
1.载体的分类
按照载体功能可分为克隆载体和表达载体；
按照载体来源可分为质粒、噬菌体、黏粒和
病毒载体等。 2.常用于构建基因疫苗的载体
基因疫苗的构建 二、基因疫苗的构建方法
1.抗原基因和载体的制备
获得需要的目的基因常用的方法：
（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基
因组DNA文库(genomic DNA library)，从
中调用目的基因；
（2）以mRNA为模板，反转录合成互补的
DNA片段，建立cDNA文库； （3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性
基因疫苗的构建
基因表达载体的组成： 为了保证抗原基因 的定向正确插入，只有 以正确的方向插入表达 载体读框启动子下游才 能表达抗原基因，故抗 原基因两端应具有不同 的酶切位点，在设计时 须注意这点。 复制原点+启动子+目的基因+终止子+标记基因
2.抗原基因与载体的连接
连接的方式可分 为粘性末端连接和平末 端连接两种，其中前者 连接效率较高，使用比 较多。连接反应时应考 虑反应体积、抗原基因 与载体的比例、温度和 时间和酶量。
粘性末端连接
质粒 目的基因 用同一种或两种 限制性内切酶酶切
DNA连接酶
重组质粒
本法适用于在 质粒和目的基 因上有相同单 或双酶切位点
平末端连接
质粒
产生平末端的 内切酶
核酸酶S1 目的基因 DNA连接酶
重组质粒
本法适用于在质粒 和目的基因上没有 相同的酶切位点！
基因疫苗的构建 3.重组质粒转化受体菌
转化：将质粒或者以它为载体构建的 重组子导入细菌的过程。 转染：将质粒或者以它为载体构建的 重组子导入真核细胞的过程。 感受态：细菌经过CaCl2溶液处理和 短暂热激后，容易摄入外源DNA，这种状态 称为感受态。其原理是细菌处于0℃、低渗 CaCl2溶液中时，细胞壁和细胞膜通透性增 加。此时转化混合物中的DNA形成抗DNase
基因疫苗的构建
4.重组质粒的筛选与鉴定
一般重组质粒鉴定主要按照表型筛 选、酶切鉴定和测序鉴定的顺序进行 （1）插入片段鉴定：酶切鉴定；PCR鉴定。 （2）插入片段方向性鉴定：可利用联合酶切 方案进行目的基因的插入方向鉴定。 （3）DNA序列测定：末端终止法测序；自动 测序仪测序
基因疫苗的构建
三、重组质粒在真核细胞中的表达与检测 1.重组质粒导入真核细胞的方法 磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、脂质体 介导等方法都可以用来将外源质粒导入真 核细胞，其中脂质体介导容易成功，是最 常用的方法。 2.抗原基因在真核细胞中表达的检测 （1）蛋白水平的检测：免疫沉淀法检测表达
由于这个过程实际上是相当 复杂的，所以人们对一些具体的 细节并不清楚。下面通过对基因 疫苗经过肌肉组织和黏膜免疫的 抗原呈递途径来说明基因疫苗的 工作原理。
基因疫苗经黏膜和皮肤组织免疫的抗原 呈递 皮肤或者黏膜是具有高水平免
疫监视系统的组织，黏膜淋巴组织的 功能：参与粘膜局部免疫应答和产生 分泌型IgA。而且在免疫动物时比较 方便，尤其是大面积预防时，所以关 于基因疫苗通过皮肤或黏膜免疫激活 机体免疫反应机制的研究也比较活跃。 基因疫苗经过黏膜和皮肤组
（1）直接免疫
旅美中国科学家范泓然用皮 肤涂抹法给小鼠接种乙肝疫苗取得成 功，且检测其效果可以和所用的肌肉 注射相媲美。黏膜淋巴结提供了浆细 胞抗体型转化与Th0细胞向Th2细胞定 向分化的微环境。基因疫苗经过黏膜
免疫可以很好地激活B细胞分泌IgA，
（2）用重组减毒胞内菌系统 采用志贺氏菌、沙门氏菌或李斯特 菌等重组减毒胞内菌系统，通过粘膜自然感 染途径运送 DNA 疫苗是一类很好的方法。 因为它们可以将基因疫苗直接呈送给 APCs ， 所以这种方法运送效率高、免疫方法简单、 免疫效果好，能同时激活粘膜免疫和全身免 疫，并可获得对载体菌的免疫等优点。 减毒沙门氏菌通过自然感染的方式 高效地将基因疫苗直接运送给体内的抗原提
携带基因疫苗重组减毒沙门氏菌诱发机体免疫应答 的机制 重组减毒沙门氏菌携带的基因疫苗激发机 体的细胞免疫和体液免疫的机制还不完 全清楚。 可能途径一：DCs 和巨噬细胞吞噬侵入肠 粘膜屏障的重组沙门氏菌并被激活，活化 的 DCs 和巨噬细胞迁移到脾脏等淋巴组 织（DCs 具有很强的迁移能力，而巨噬细 胞尚有一些疑问），载体菌在此裂解，基 因疫苗进入胞液，然后进入细胞核，最后 表达目的抗原。接着激活特异的 CTL ， 裂解表达抗原的 APCs ， APCs 内的抗原