细胞周期与细胞同步化

一、细胞周期
世纪50年代细胞周期学说建立后 自20世纪 年代细胞周期学说建立后， 世纪 年代细胞周期学说建立后， 人们对培养细胞的增殖过程和周期规律 已有了很深的了解。 已有了很深的了解。 整个细胞周期经历两个时期，即分裂间 整个细胞周期经历两个时期， 期和有丝分裂期， 期和有丝分裂期，分裂间期也是细胞生 长阶段，是为有丝分裂过程做准备的， 长阶段，是为有丝分裂过程做准备的， 近些年又将间期分为G 近些年又将间期分为 1期（DNA合成 合成 前期）、 ）、S期 合成期）、 前期）、 期（DNA合成期）、 G2期 合成期 合成后期）。 （DNA合成后期）。 合成后期
3.纺缍体形成 纺缍体形成 中心粒:2套中心粒分离, :2套中心粒分离 中心粒:2套中心粒分离,向两极移动成为纺缍 体的两个极. 体的两个极. 是微管组织中心 纺缍体:中心体向两侧移动中, 微管聚合, 纺缍体:中心体向两侧移动中, 微管聚合,成纺 缍状结构， 缍状结构，由三种微管组成 星体微管：卧放射状 星体微管： 极微管：由纺缍体一极发出，伸向另一极， 极微管：由纺缍体一极发出，伸向另一极， 在赤道部位相互重叠, 在赤道部位相互重叠,由动力蛋白连接 动粒微管：由一极发出, 动粒微管：由一极发出, 与染色体的动粒连接
G2期
概况： 概况： 时期:分裂之前 时期 分裂之前 基本特点：进行诱发细胞进入分裂的 基本特点 进行诱发细胞进入分裂的 进行诱发细胞进入分裂 各种生化变化 各种生化变化 时间：较短， 时间 较短，约2~3 hr 较短
特点： 特点 机能活动为分裂作准备 机能活动为分裂作准备 继续合成与分裂有关的物质 继续合成与分裂有关的物质 主要合成分裂有关的蛋白质 尤以细胞骨架，重新组装的蛋白质， 尤以细胞骨架，重新组装的蛋白质， 如阻止蛋白质合成, 如阻止蛋白质合成,细胞不进入分裂 此期DNA已加倍，染色质开始螺旋化， DNA已加倍 此期DNA已加倍，染色质开始螺旋化， 但程度轻。 但程度轻。
细胞周期示意图
G 1期
时期: 时期:子细胞继续生长时期 时间:变化大,几小时～ 时间:变化大,几小时～几天 特点： 特点：细胞生长主要阶段 能对各种环境信号,综合、协调、作出反 能对各种环境信号,综合、协调、 应以确定是否进入S 应以确定是否进入S期 时间长度变异大：人体200多种细胞， 时间长度变异大：人体200多种细胞， 200多种细胞 周期时间不同,主要在G 周期时间不同,主要在G1 如：胚胎早期卵裂细胞 几乎测不到 淋巴细胞 神经元细胞 数小时 终生停在G1期 终生停在G1期 G1
3．N2阻断法 ． 此方法较秋水仙胺阻抑法好。 此方法较秋水仙胺阻抑法好。 (1)将细胞传代培养至指数生长期。 将细胞传代培养至指数生长期。 将细胞传代培养至指数生长期 (2)将培养瓶置于 2罐中通人适量 将培养瓶置于N 将培养瓶置于 CO2(约相当于罐中体积的 ％)。 约相当于罐中体积的5％ 。 约相当于罐中体积的 (3)关闭好 2罐，接上 2管子及压力 关闭好N 接上N 关闭好 缓缓向罐中充气一直到压力为80表，缓缓向罐中充气一直到压力为 90磅为止。 磅为止。 磅为止
末期 要点:细胞质分裂 形成2个子细胞 细胞质分裂， 要点 细胞质分裂，形成 个子细胞 时间:20~30 min 时间 胞质中重新出现正常结构 特点 胞质中重新出现正常结构 纺缍体消失， 纺缍体消失， 新的细胞核膜形成 形成染色质： 形成染色质：染色体解螺旋化 胞质分裂 形成特殊临时性结构一收缩环 细胞膜内陷,分裂沟 分裂沟… 细胞膜内陷 分裂沟 细胞形状 细胞拉长中部变细，缩窄加深， 细胞拉长中部变细，缩窄加深， 2个子细胞 个子细胞
(2)S期的蛋白质合成 )S期的蛋白质合成 DNA复制过程中需不断合成蛋白质 DNA复制过程中需不断合成蛋白质 如阻断蛋白质合成( 如阻断蛋白质合成 ( 加入抑制合成蛋白质 药物如嘌呤霉素) 将同时影响DNA DNA合成速 药物如嘌呤霉素 ) 将同时影响 DNA 合成速 组蛋白的合成与DNA合成也有关， DNA合成也有关 度，组蛋白的合成与DNA合成也有关，如 抑制DNA合成(加入抑制DNA DNA合成 DNA合成药物如羟 抑制DNA合成(加入抑制DNA合成药物如羟 基脲、阿霉素)也出现组蛋白合成阻断， 基脲、阿霉素)也出现组蛋白合成阻断， DNA复制中 DNA和组蛋白互为条件 复制中， 和组蛋白互为条件、 DNA 复制中 ， DNA 和组蛋白互为条件 、 相 互制约。 互制约。
M期 期
概况
时期 基本特点 时间 分期 最终阶段 形态、结构变化最大， 形态、结构变化最大， 细胞增殖标志 短，较恒定 前、中、后，末
前期
概况 染色质凝集，核被膜崩解， 染色质凝集，核被膜崩解， 纺缍体形成 20~30分 分 特点 1.染色体组装 染色质疑集，M期开始 染色体组装:染色质疑集 染色体组装 染色质疑集， 期开始 分裂前须先染色质组装成染色体 分裂前须先染色质组装成染色体 染色质逐渐变短， 染色质逐渐变短，变粗 核膜破裂， 核膜破裂，已成染色体 2. 核被膜破裂 核被膜消失， 核被膜消失，前期结束
S期 期
概况 时期: 时期 DNA合成时期 合成时期 基本特点:为分裂作准备,DNA复制 基本特点 为分裂作准备 复制 时间： 时间：约10 h左右 左右 DNA合成时期是遗传物质易受致突变物 合成时期是遗传物质易受致突变物 损伤的时期
特点 (1)主要为DNA合成（DNA复制） (1)主要为DNA合成（DNA复制） 主要为DNA合成 复制 开始时，急剧形成DNA聚合酶 开始时，急剧形成DNA聚合酶 DNA 种脱氧核苷酸以后， 及4种脱氧核苷酸以后，DNA加倍 DNA复制是增殖的基础 DNA复制是增殖的基础 完成DNA复制，才能入M 完成DNA复制，才能入M期． DNA复制
体外培养的细胞各自处于细胞周期的 不同阶段，具有分裂不同步性， 不同阶段，具有分裂不同步性，只有 使细胞周期同步化， 使细胞周期同步化，获得大量同周期 阶段的细胞， 阶段的细胞，才能更深入的研究细胞 状态和生化特点， 状态和生化特点，便于进行细胞动力 学和其他有关实验。 学和其他有关实验。 细胞同步化的实验是以细胞周期理论 为基础的。 为基础的。
(一)M期同步化方法 期同步化方法 1．振荡收集法 ． 该法利用M期细胞变圆易脱落的特点， 该法利用 期细胞变圆易脱落的特点， 期细胞变圆易脱落的特点 将生长旺盛的贴壁细胞按一定的时间间 隔振荡， 期细胞脱落， 隔振荡，使M期细胞脱落，逐步收集培 期细胞脱落 养基，并补充新的培养基。 养基，并补充新的培养基。收集的细胞 度冰箱中保存， 放4度冰箱中保存，离心沉淀后即获得 度冰箱中保存 M期细胞。 期细胞。 期细胞
(3)荡收集细胞，800 r／min离心 荡收集细胞， 离心5—10 荡收集细胞 ／ 离心 min，弃上清，收集的沉淀细胞即为 ，弃上清，收集的沉淀细胞即为M 期细胞。 期细胞。 加入一定量培养基将细胞接种到培养瓶 中或直接进行离体实验。 中或直接进行离体实验。 由于秋水仙素、 由于秋水仙素、秋水仙胺对细胞有一定 毒性， 毒性，用量较小或作用时间较短细胞活 性尚可恢复， 性尚可恢复，而用量过大或时间过长则 细胞不能存活， 细胞不能存活，因此使用时应严格控制 其剂量和作用时间
中期 概况： 概况： 要点:纺缍体及赤道形成时间:20～30分 要点:纺缍体及赤道形成时间:20～30分 时间:20 特点: 特点: 有丝分裂器： 由纺缍体、染色体、 有丝分裂器： 由纺缍体、染色体、中心粒 组成的临时装置 组成的临时装置 纺缍体：已形成， 纺缍体：已形成，稳定 染色体：高度浓缩，形成赤道板 染色体：高度浓缩， 如不能形成赤道板细胞不能进 入后期。 入后期。 细胞形状： 圆形、 细胞形状： 圆形、易脱落
后期 要点:染色单体 分离.后期开始 要点 染色单体 分离 后期开始 时间:5~7 min 最快 时间 特点: 特点 染色体向两极移动， 染色体向两极移动， 染色体动粒部 位不断解聚。 位不断解聚。使动粒微管缩短 使染色体向两极移动(拉动 拉动) 使染色体向两极移动 拉动 加速聚合、伸长， 极微管 ： 加速聚合、伸长，使相 互重叠的部分产生滑动， 互重叠的部分产生滑动， 使纺缍体两极之间距离加大， 使纺缍体两极之间距离加大， 纺缍体延长(推动 推动) 纺缍体延长 推动 细胞形状 略变长
第八章 细胞周期与细胞同步化
培养的有机体细胞的增生与体内细 胞一样， 胞一样，也是借助于细胞有丝分裂 而实现的。 而实现的。 细胞从一次有丝分裂结束到下一次 有丝分裂结束所经历的全过程， 有丝分裂结束所经历的全过程，成 为细胞周期。 为细胞周期。
尽管建立了细胞株，获得了细胞克隆， 尽管建立了细胞株，获得了细胞克隆， 但这些细胞的生命周期并不是完全同步 的，即在某一时间只有少数细胞进行着 有丝分裂活动， 有丝分裂活动，表现出细胞分裂的不同 步性。 步性。 在研究工作中， 在研究工作中，除了要调节细胞的培养 环境， 环境，为之创造与机体内细胞基本相同 的生存条件，还要研究细胞内调控， 的生存条件，还要研究细胞内调控，使 之按照人的意愿生长或合成产物。 之按照人的意愿生长或合成产物。
细胞周期同步化的意义在于可获得 大量同周期阶段的细胞， 大量同周期阶段的细胞，从而对其 进行生化分析， 进行生化分析，深入了解细胞周期 中各个不同阶段细胞的结构与功能， 中各个不同阶段细胞的结构与功能， 以及研究细胞周期中有关基因的调 控与表达等。 控与表达等。
选用DNA合成抑制剂可逆地抑制 合成抑制剂可逆地抑制 选用 S期DNA合成而不影响其他细胞周期运 期 合成而不影响其他细胞周期运 最终可将细胞群体阻断在G1／ 期 转，最终可将细胞群体阻断在 ／S期 交界处 一些抑制微管聚合的药物， 一些抑制微管聚合的药物，因抑制有丝 分裂装置的形成和功能行使， 分裂装置的形成和功能行使，可将细胞 阻断在有丝分裂中期， 阻断在有丝分裂中期，即使细胞同步于 M期。 期 细胞同步化实际包括用一定的方法获得 一定数量的同步化细胞群和使细胞进入 同步化生长的两层含义。 同步化生长的两层含义。
2．秋水仙胺阻抑法 ． (1)将细胞传代培养至指数生长期。 将细胞传代培养至指数生长期。 将细胞传代培养至指数生Байду номын сангаас期 (2)加入秋水仙胺，使最终浓度为 加入秋水仙胺， 加入秋水仙胺 0.05—0.1µg／mL培养基，作用 ／ 培养基， 培养基 6—7 h。如使用秋水仙素，使用浓 。如使用秋水仙素， 度应加大5～ 倍 度应加大 ～10倍。
(4)将N2装置放在 ℃培养箱中 将 装置放在 装置放在37℃ 10—16 h(通常过夜 。次日从培养箱 通常过夜)。 通常过夜 中取出，然后缓缓将N2放出 放出(最好放 中取出，然后缓缓将 放出 最好放 出窗外)。 出窗外 。 (5)取出细胞在镜下观察同步化效 取出细胞在镜下观察同步化效 果，用振荡法收集细胞于离心管中。 用振荡法收集细胞于离心管中。 (6)800 r／min离心 min收集细 离心10 ／ 离心 收集细 胞。
(二)S期同步化方法 二 期同步化方法 胸腺嘧啶核苷(TdR)双阻断法：该 双阻断法： 胸腺嘧啶核苷 双阻断法 法利用过量TdR能阻碍 能阻碍DNA合成的原理 法利用过量 能阻碍 合成的原理 而设计，为了加强细胞同步化效果， 而设计，为了加强细胞同步化效果，常 采用两次TdR阻断法，即双阻断法。 采用两次 阻断法，即双阻断法。 阻断法 次阻断时间相当于G 第1次阻断时间相当于 2、M和G1期时 次阻断时间相当于 和 间的总和或稍长，释放时间不短于S期 间的总和或稍长，释放时间不短于 期 时间，而小于G 期时间， 时间，而小于 2+M+G1期时间，
二、细胞同步化
在一般培养条件下， 在一般培养条件下，群体中的细胞 处于不同的细胞周期时相之中。 处于不同的细胞周期时相之中。 为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、 为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、 基因表达或凋亡， 基因表达或凋亡，常需采取一些方法使 细胞处于细胞周期的同一时相， 细胞处于细胞周期的同一时相，这就是 细胞同步化技术。 细胞同步化技术。