实验七 唾液钙和磷含量的测定

实验七唾液钙和磷含量的测定

唾液中钙与磷的测定都是采用分光光度法进行检测的，可结合自己现有的试剂和实验条件选择完成。

（一）唾液中钙含量的测定

甲基麝香草酚蓝法（MTB）是络合与比色方法相结合的方法，该方法的灵敏度高，操作简便。

【目的与要求】

通过实验掌握测定唾液中钙浓度的基本原理和方法，了解分光光度法的定量原理。

【实验原理】

在碱性条件下，甲基麝香草酚蓝与钙形成深蓝色甲基麝香草酚蓝钙的络合物，该络合物在610nm处有最佳吸收，可采用比色法测定，进而算出唾液中的总钙含量。

【实验内容】

1.收集口腔唾液

2.测定唾液中的总钙含量

【实验设备和用品】

分光光度计，振荡器，试管，移液器，EP管，烧杯，滴管和吸头等。

【试剂及其配制】

1.显色基础液（A）称取亚硫酸钠

2.40g，溶解于70ml双蒸水中，再加乙醇胺20.0ml，加双蒸水至100ml，储于40C冰箱备用。

2.MTB试剂（B）称取甲基麝香草酚蓝0.018g\8-羟基喹咛0.36g 和聚乙烯吡咯酮0.6g，加入50%三氯醋酸1.0ml、30%乙醇99ml，内含0.1mol/LEDTA-Na2，pH=

3.0，置于2~4℃冰箱中保存。

3.反应夜（C）将A和B等量混合，静置20后即可使用。此试剂在2~8℃冰箱中保存2天。

4.钙标准存储液将碳酸钙放入110℃恒温干燥箱中干燥过夜，冷却后，准确称取2.5g，加少量双蒸水，再加入浓盐酸5ml，待碳酸钙完全溶解后，用双蒸水定容至1000ml，储存于塑料瓶中备用。

5.钙标准应用液取钙标准储存液10ml，用双蒸水稀释至100ml，使钙标准应用液浓度为2.5mmol/L。

[方法和步骤]

1.标本收集及处理收集非刺激性唾液约0.5ml，取0.2ml加10%三氯醋酸3.8ml，充分混匀，放置10分钟，3000r/min离心10分钟，取上清液备测。

2.测定准备三组EP管，按表7-4顺序分别加入试剂：

表7-4 唾液中钙含量测定

试剂（ml）测定管标准管空白管

待测唾液样本0.05 ——

钙标准应用液—0.05 —蒸馏水——0.05

反应液 3.0 3.0 3.0

各管在振荡器上混匀，以空白管校正零点，在分光光度计上测定

612nm波上下的OD值，按下式计算含量：

样品中钙的浓度（mmol/L）=样品管光密度/标准管光密度×2.5 [注意事项]

1.为保证测试结果的可靠性，所有实验器皿一定要清洗干净且用三蒸水多次冲洗、烤干后待用。也可在试剂中加入少量的EDTA作掩蔽剂，消除实验器皿和试剂中的钙污染，在试剂中加入8-羟基喹咛以去除镁的干扰。

2.为避免玻璃中的钙离子溶出，钙标准贮存液用塑料瓶保存。

3.为提高分析结果的准确度，减少偶然误差，应增加平行测定次数。

4.本实验所测结果为唾液中总钙浓度。

[思考题]

1.试分析唾液中钙含量检测误差产生的原因？

2.唾液中钙含量计算的方法有哪些

第四节骨组织生物学和口腔细胞培养

实验十成骨细胞的分离培养

[实验目的与要求]

掌握分离、培养和鉴定成骨细胞方法，了解成骨细胞的功能与特性。

[实验原理]

骨是机体中代谢非常活跃的组织，一生都在不断的更新与改建。在需要改建的部位，破骨细胞不断吸收骨基质；而在其相对的一侧，成骨细胞不断分泌新的骨基质，并不断钙化。在生理状态下，成骨细胞（osteoblast）的一个显著特征就是可形成矿化结节，因此本实验采用Alizarin Red染色法，能过对形成的矿化结节进行染色等来鉴定成骨细胞。

[实验内容]

1.成骨细胞的收集。

2.成骨细胞的培养。

3.成骨细胞的鉴定。

[材料、用品与设备]

超净工作台，倒置相差显微镜，CO2培养箱，消毒的手术剪、刀及眼科手术镊等。

[试剂及其配制]

1. -MEM培养基。

2.0.5%茜素红用pH7.2的1%Tris-HCL配制。

3.碱性磷酸酶（ALP）染色用孵育液取2%巴比妥钠5ml、3%β-甘油磷酸钠5ml、2%酸钙及2%硫酸镁5ml分别加入量筒，再加入蒸馏水25ml后搅拌溶解。

[实验方法]

1.成骨细胞的收集

（1）取出生10天内的大耳白兔，乙醚麻醉后，清洗，用75%酒精浸泡消毒5分钟，取出，置超净工作台内，擦干残余酒精，无菌条件下剪开皮肤后环形剪下颅骨（顶骨及额骨）。

（2）用含500U/ml青霉素、500gμ/ml链霉素的无菌PBS液冲洗3次，并用剪刀和镊子剔除黏附的结缔组织和血管，剪碎成约1mm3大小。

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