人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒(酶联免疫法)

人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒（酶联免疫法）

人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus HIV）是导致人类获得性免疫缺陷综合征（Acquired Immunodeficiency Syndrome AIDS）的病原体。HIV通过血液传播、性传播和母婴传播三种途径在人群中流行和扩散。1981年美国报道第一例艾滋病病例，至2009年年底，全球有存活的HIV感染者大约3330万例。我国1985年报告第一例艾滋病传入病例，截止2009年12月，估计有存活的HIV感染者74万人。

HIV进入人体以后，感染和破坏人体的CD4+T淋巴细胞，快速复制繁殖，病毒数量迅速增加。在感染的初期，病毒载量的水平很高，传染的危险大，急性期以后，病毒载量下降到相对稳定的定点（Set point）水平，在长达5～10年的临床潜伏期内，病毒载量和CD4+T淋巴细胞数量都保持相对稳定，这实际上是一种动态平衡，身体内每天有上亿个病毒被清除，也有相同数量的病毒产生，同样也有大约上亿个CD4+T淋巴细胞被破坏，有相同数量的细胞再生。到了病程晚期，免疫细胞被耗竭，病毒大量复制，病毒载量升高，免疫功能崩溃，病人因发生各种机会性感染或肿瘤而死亡。

人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒是艾滋病防治的有力工具，广泛应用于献血员筛选、临床诊断和流行病学调查。1985年3月美国FDA批准了第一种人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒，这是艾滋病防治进程中重要的里程碑、开启了科学防治艾滋病的时代。

一、人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus HIV）

HIV在分类上属于逆转录病毒科、慢病毒属、灵长类慢病毒群。病毒呈球形颗粒，被来自宿主细胞膜的脂质双层膜包裹，基因组结构大致是5’LTR，gag，pro，pol，env，3’LTR，5’端有帽状（cap）结构，3’端有多聚腺苷酸Poly (A) 序列，如果去掉Poly (A)，基因组全长9100bp。HIV基因及其编码的蛋白至少有9种，可以大致分为三组：主要结构基因和结构蛋白（Gag、Pol和Env）、调节基因和调节蛋白（Tat 和Rev）、附属基因和附属蛋白（Vpu、Vpr、Vif和Nef）。

HIV是迄今为止发现的人类最大遗传变异的病原体，可以分为HIV-1型和

HIV-2型，HIV-1又分为3个群，分别是M群(Major)、O群(Outlier)和N群(non-M/non-O)。HIV-1与HIV-2的核苷酸序列差异达到50%以上，HIV-1各群之间的差异达到30%以上。HIV-1M群在全球广泛流行，而HIV-2和HIV-1的O群和N 群只在非洲的局部地区流行。HIV-1M群病毒有多种变异株，根据基因变异程度，分为13个型或亚亚型（A1～A4、B、C、D、F1～F2、G、H、J和K）以及49个重组型（Circulate Recombinant Forms CRFs）。根据病毒的部分gag、pol和env 片段序列对HIV-1O群病毒进行分型，发现O群病毒同样具有高度的变异性，但不象M群病毒那样有不同的亚型分类。HIV-1N群病毒感染的人数很少，报道的只有不到10人，进化树分析显示，N群病毒形成与M群病毒相关的独立的簇，它们的3’端序列更接近于猴免疫缺陷病毒（Simian Immunodeficiency Virus SIV）SIVcpzUS株。对HIV-2的流行病学和分子进化的研究比HIV-1 O群和N群更为深入。HIV-2可以分为A～G亚型，但只有A和B亚型测定了3个以上毒株的全长基因组序列。HIV-2核苷酸和氨基酸序列的差异比HIV-1M群内的更大，HIV-2的亚型更相似于HIV-1M、N、O之间的序列差异。

HIV-1不同亚型毒株之间的重组十分常见，称为重组流行毒株（Circulate Recombinant Forms CRFs ）。CRFs按照文献报道的先后顺序排列，目前已经确定了49个HIV-1的重组流行毒株。确定一个新的CRF的条件是在3个独立的没有流行病学联系的病人发现该病毒并进行了全基因组序列测定。近年发现了大量不满足命名CRF条件的重组病毒，称为独特重组型（Unique Recombinant Forms URF）。我国流行的HIV毒株主要是HIV-1，已发现的有A、B、B’（Thai B）、C、D、F和G 7个亚型, 另外还有很多重组流行毒株，常见的是CRF07_BC、CRF08_BC、CRF01_AE和CRF02_AG。在我国部分地区发现有少数HIV-2感染者。

二、人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒研发和使用的历程

1983年法国科学家蒙塔尼等分离出人类免疫缺陷病毒（HIV）。1985年3月，美国FDA批准了第1种HIV抗体EIA检测试剂，在此后20多年的时间内HIV 诊断试剂有了长足的进展，由间接法发展到夹心法、从单纯检测抗体到同时检测抗原和抗体、从检测单一HIV亚型到检测HIV-1 M群、O群和HIV-2，已经从

最初的第一代试剂发展到目前的第四代试剂。艾滋病诊断试剂是准确诊断HIV 感染、阻断HIV的经血传播的有力工具，对于遏制艾滋病的传播和流行发挥了重要的作用。

第一代HIV抗体诊断试剂使用HIV-1的全病毒裂解抗原，检测原理为EIA 间接法，应用于献血员的筛选，使得经血液传播HIV的危险由1984年的0.2%下降为1988年的1/40000-1/250000，大幅度减少了经血传播HIV的发生。第一代试剂使用纯化裂解的HIV-1抗原，标本易于与培养HIV-1的细胞成份发生反应，出现较多非特异反应，检测的敏感性也不好。

随着分子生物学技术的发展，HIV抗原的制备方法也由病毒培养裂解发展为基因工程克隆表达和多肽合成。1990年，美国FDA批准了第一种使用基因工程或合成肽抗原的、基于间接ELISA的HIV抗体诊断试剂，也称为第二代试剂。1986年，在西非的艾滋病患者标本中又分离出为HIV-2，用HIV-1抗体诊断试剂检测HIV-2阳性标本常常发生漏检，针对这种情况，在包被的HIV-1抗原中加入HIV-2的gp36多肽，研发出HIV-1/HIV-2抗体联检试剂，使标本中的HIV-1和/或HIV-2抗体均可显示阳性反应，1992年2月14日FDA正式批准了这种试剂。第二代试剂的敏感性和特异性均较第一代试剂显著提高，据测算，使用第二代试剂，窗口期平均比第一代试剂缩短20.3天。

1994年，美国FDA批准了检测HIV-1/HIV-2抗体的双抗原夹心法ELISA试剂，又称为第三代试剂。这种试剂的酶标记物由抗人IgG改变为特异性HIV抗原，反应模式由第一代和第二代试剂的间接法改变为双抗原夹心法。由于包被和标记的都是HIV抗原，因而可以检测HIV抗体的不同亚类，包括IgG、IgM、IgA 等，同时不需要通过稀释标本来保证特异性，因而具有较高的敏感性。第三代试剂比第二代试剂检出HIV抗体的时间大约提前4～9天，有的报告可以提前14天。1994年，在喀麦隆发现了HIV-1 O群病毒，一些研究发现HIV-1/HIV-2试剂检测O群标本常常出现假阴性，为解决O群病毒的诊断问题，在包被和标记的HIV抗原中加入HIV-1 O群特异性多肽，1997年FDA批准了第三代HIV1/2/O 抗体诊断试剂。

在第三代试剂的基础上，1998年FDA批准了第一种HIV抗原抗体联检试剂，又称为第四代试剂。这种试剂基于ELISA夹心法原理，包被和标记HIV-1、HIV-2