人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒(酶联免疫法)

人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒（酶联免疫法）
人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus HIV）是导致人类获得性免疫缺陷综合征（Acquired Immunodeficiency Syndrome AIDS）的病原体。

HIV通过血液传播、性传播和母婴传播三种途径在人群中流行和扩散。

1981年美国报道第一例艾滋病病例，至2009年年底，全球有存活的HIV感染者大约3330万例。

我国1985年报告第一例艾滋病传入病例，截止2009年12月，估计有存活的HIV感染者74万人。

HIV进入人体以后，感染和破坏人体的CD4+T淋巴细胞，快速复制繁殖，病毒数量迅速增加。

在感染的初期，病毒载量的水平很高，传染的危险大，急性期以后，病毒载量下降到相对稳定的定点（Set point）水平，在长达5～10年的临床潜伏期内，病毒载量和CD4+T淋巴细胞数量都保持相对稳定，这实际上是一种动态平衡，身体内每天有上亿个病毒被清除，也有相同数量的病毒产生，同样也有大约上亿个CD4+T淋巴细胞被破坏，有相同数量的细胞再生。

到了病程晚期，免疫细胞被耗竭，病毒大量复制，病毒载量升高，免疫功能崩溃，病人因发生各种机会性感染或肿瘤而死亡。

人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒是艾滋病防治的有力工具，广泛应用于献血员筛选、临床诊断和流行病学调查。

1985年3月美国FDA批准了第一种人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒，这是艾滋病防治进程中重要的里程碑、开启了科学防治艾滋病的时代。

一、人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus HIV）
HIV在分类上属于逆转录病毒科、慢病毒属、灵长类慢病毒群。

病毒呈球形颗粒，被来自宿主细胞膜的脂质双层膜包裹，基因组结构大致是5’LTR，gag，pro，pol，env，3’LTR，5’端有帽状（cap）结构，3’端有多聚腺苷酸Poly (A) 序列，如果去掉Poly (A)，基因组全长9100bp。

HIV基因及其编码的蛋白至少有9种，可以大致分为三组：主要结构基因和结构蛋白（Gag、Pol和Env）、调节基因和调节蛋白（Tat 和Rev）、附属基因和附属蛋白（Vpu、Vpr、Vif和Nef）。

HIV是迄今为止发现的人类最大遗传变异的病原体，可以分为HIV-1型和
HIV-2型，HIV-1又分为3个群，分别是M群(Major)、O群(Outlier)和N群(non-M/non-O)。

HIV-1与HIV-2的核苷酸序列差异达到50%以上，HIV-1各群之间的差异达到30%以上。

HIV-1M群在全球广泛流行，而HIV-2和HIV-1的O群和N 群只在非洲的局部地区流行。

HIV-1M群病毒有多种变异株，根据基因变异程度，分为13个型或亚亚型（A1～A4、B、C、D、F1～F2、G、H、J和K）以及49个重组型（Circulate Recombinant Forms CRFs）。

根据病毒的部分gag、pol和env 片段序列对HIV-1O群病毒进行分型，发现O群病毒同样具有高度的变异性，但不象M群病毒那样有不同的亚型分类。

HIV-1N群病毒感染的人数很少，报道的只有不到10人，进化树分析显示，N群病毒形成与M群病毒相关的独立的簇，它们的3’端序列更接近于猴免疫缺陷病毒（Simian Immunodeficiency Virus SIV）SIVcpzUS株。

对HIV-2的流行病学和分子进化的研究比HIV-1 O群和N群更为深入。

HIV-2可以分为A～G亚型，但只有A和B亚型测定了3个以上毒株的全长基因组序列。

HIV-2核苷酸和氨基酸序列的差异比HIV-1M群内的更大，HIV-2的亚型更相似于HIV-1M、N、O之间的序列差异。

HIV-1不同亚型毒株之间的重组十分常见，称为重组流行毒株（Circulate Recombinant Forms CRFs ）。

CRFs按照文献报道的先后顺序排列，目前已经确定了49个HIV-1的重组流行毒株。

确定一个新的CRF的条件是在3个独立的没有流行病学联系的病人发现该病毒并进行了全基因组序列测定。

近年发现了大量不满足命名CRF条件的重组病毒，称为独特重组型（Unique Recombinant Forms URF）。

我国流行的HIV毒株主要是HIV-1，已发现的有A、B、B’（Thai B）、C、D、F和G 7个亚型, 另外还有很多重组流行毒株，常见的是CRF07_BC、CRF08_BC、CRF01_AE和CRF02_AG。

在我国部分地区发现有少数HIV-2感染者。

二、人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒研发和使用的历程
1983年法国科学家蒙塔尼等分离出人类免疫缺陷病毒（HIV）。

1985年3月，美国FDA批准了第1种HIV抗体EIA检测试剂，在此后20多年的时间内HIV 诊断试剂有了长足的进展，由间接法发展到夹心法、从单纯检测抗体到同时检测抗原和抗体、从检测单一HIV亚型到检测HIV-1 M群、O群和HIV-2，已经从
最初的第一代试剂发展到目前的第四代试剂。

艾滋病诊断试剂是准确诊断HIV 感染、阻断HIV的经血传播的有力工具，对于遏制艾滋病的传播和流行发挥了重要的作用。

第一代HIV抗体诊断试剂使用HIV-1的全病毒裂解抗原，检测原理为EIA 间接法，应用于献血员的筛选，使得经血液传播HIV的危险由1984年的0.2%下降为1988年的1/40000-1/250000，大幅度减少了经血传播HIV的发生。

第一代试剂使用纯化裂解的HIV-1抗原，标本易于与培养HIV-1的细胞成份发生反应，出现较多非特异反应，检测的敏感性也不好。

随着分子生物学技术的发展，HIV抗原的制备方法也由病毒培养裂解发展为基因工程克隆表达和多肽合成。

1990年，美国FDA批准了第一种使用基因工程或合成肽抗原的、基于间接ELISA的HIV抗体诊断试剂，也称为第二代试剂。

1986年，在西非的艾滋病患者标本中又分离出为HIV-2，用HIV-1抗体诊断试剂检测HIV-2阳性标本常常发生漏检，针对这种情况，在包被的HIV-1抗原中加入HIV-2的gp36多肽，研发出HIV-1/HIV-2抗体联检试剂，使标本中的HIV-1和/或HIV-2抗体均可显示阳性反应，1992年2月14日FDA正式批准了这种试剂。

第二代试剂的敏感性和特异性均较第一代试剂显著提高，据测算，使用第二代试剂，窗口期平均比第一代试剂缩短20.3天。

1994年，美国FDA批准了检测HIV-1/HIV-2抗体的双抗原夹心法ELISA试剂，又称为第三代试剂。

这种试剂的酶标记物由抗人IgG改变为特异性HIV抗原，反应模式由第一代和第二代试剂的间接法改变为双抗原夹心法。

由于包被和标记的都是HIV抗原，因而可以检测HIV抗体的不同亚类，包括IgG、IgM、IgA 等，同时不需要通过稀释标本来保证特异性，因而具有较高的敏感性。

第三代试剂比第二代试剂检出HIV抗体的时间大约提前4～9天，有的报告可以提前14天。

1994年，在喀麦隆发现了HIV-1 O群病毒，一些研究发现HIV-1/HIV-2试剂检测O群标本常常出现假阴性，为解决O群病毒的诊断问题，在包被和标记的HIV抗原中加入HIV-1 O群特异性多肽，1997年FDA批准了第三代HIV1/2/O 抗体诊断试剂。

在第三代试剂的基础上，1998年FDA批准了第一种HIV抗原抗体联检试剂，又称为第四代试剂。

这种试剂基于ELISA夹心法原理，包被和标记HIV-1、HIV-2
和HIV-1 O群的抗原以及HIV-1 p24抗原的抗体，能够同时检测HIV-1/HIV-2/HIV-1 O群病毒的抗体以及HIV-1 p24抗原，可检测早期的血清阳转，进一步提高输血的安全性。

临床考核证实，第四代试剂检测早期HIV感染的效果与单独检测HIV-1抗原的试剂相当，比检出HIV RNA的时间平均滞后约3.23天，与第三代抗体试剂相比，窗口期缩短了1.56到5.32天，敏感性和特异性均有所提高。

近年来，采用化学发光方法检测HIV抗体试剂的研发取得了快速发展，这种方法化学发光反应与免疫反应相结合检测标本中的HIV抗体，既具有免疫反应的高度特异性，又具有发光反应的高敏感性。

化学发光方法包括三类，一是化学发光酶免疫测定（CLEIA），采用化学发光剂作为酶反应的底物，经过酶和发光两级放大，提高敏感性；二是化学发光免疫测定（CLIA），用化学发光剂直接标记抗原的测定方法；三是电化学发光免疫测定（ECLI），是在电极表面由电化学反应引发特异性的发光反应，测定模式与ELISA相似。

自1996年我国研制出第一种HIV抗体诊断试剂以来，我国HIV诊断试剂也取得了快速发展，目前多数厂家生产的都是第三代试剂，也有国产的第四代试剂被批准上市，我国HIV诊断试剂的质量也稳步提高，主要性能指标达到国际同类产品的水平。

三、HIV抗体应答的动态及检测的意义：
机体感染HIV以后将产生针对HIV主要抗原的特异性抗体，如抗p17、p24、p31、gp41、p51、p55、p66、gp120、gp160的抗体，同时也可以产生一些针对病毒调节蛋白的抗体。

对HIV不同抗原的反应性与感染的进程有关，也存在一定的个体差异。

HIV感染产生抗体应答后，抗体将终生存在，绝大多数可检测的HIV抗体是结合抗体，不能中和病毒，抗体与病毒血症同时存在，因此，除18个月以下的新生儿以外，HIV抗体阳性就意味HIV感染。

针对不同抗原成分的抗体不是同时出现的，gag蛋白（p24 p55）的抗体通常出现得最早，而针对env (gp41 gp120 gp160 ) 和pol ( p66 p51 p31 ) 蛋白的抗体可能同时或稍后才出现，p24抗原的抗体可能随着疾病的进展而下降或与p24抗原结合形成抗原抗体复合物，gp41的抗体稳定而持久，是HIV抗体检测的主要
抗体。

不同个体对HIV抗原的抗体应答也可能有差异，有人可能对p24抗原的反应较强，而另一些人可能对gp160的应答较强，但大多数感染者将对病毒所有的抗原成分产生抗体应答。

抗体产生的时间取决于宿主的反应性和病毒的特性，一般是感染以后1～3个月出现抗体，感染以后到抗体产生之前这段时间称为感染后的窗口期。

随着感染的发展，抗体的浓度和滴度将逐渐增加，抗体也将由阴性转为阳性，这个过程又称为血清阳转（seroconversion）。

窗口期的长短有一定的个体差异，也与检测方法的种类和敏感性有关。

如果在抗体检测以外，还检测HIV抗原和核酸，可以缩短窗口期，检测P24抗原可以将窗口期缩短大约1周，检测HIV RNA又可使窗口期缩短大约1周。

使用同一种检测方法，如果敏感性较高则窗口期较短，反之，窗口期较长，因此检测从HIV感染之前到感染以后一定时间内的系列血液标本，根据呈现阳性反应的时间可判断检测方法的敏感性。

婴儿可以在出生前通过胎盘和出生后通过乳汁被动获得母体的IgG，出生后8～14个月，母体的IgG在婴儿体内逐渐消失，18个月以后，婴儿的免疫系统才能够产生自己的抗体。

因此，HIV阳性母亲所生婴儿检出HIV抗体不一定表明受到HIV感染。

可采用核酸检测方法诊断新生儿HIV的感染。

四、双抗原夹心法：
酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）检测抗体的模式有多种，包括间接法、夹心法、竞争法等。

双抗原夹心法的原理是将HIV抗原包被到固相载体上，标本中的HIV抗体与抗原结合形成复合物，由于抗体的双价或多价性，它同时还能与其他抗原结合，加入酶标记的同一类HIV 抗原分子时，后者就会与固相载体上的抗体结合，形成HIV抗原-HIV抗体-酶标记HIV抗原复合物，最后加入底物发生酶催化的显色反应，测定光密度值（Optical density OD），与判断标准进行比较，就可以得知标本中HIV抗体是阳性还是阴性。

五、专用原材料
1. HIV抗原：
HIV的结构蛋白由三个结构基因（gag、pol、env）编码。

gag基因编码病毒的核心蛋白，首先编码一个55Kd的前体蛋白（p55），然后在蛋白酶的作用下裂解成p17、p24和p15，由它们构建成病毒的外壳和内膜。

Pol基因编码病毒复制所需要的酶类，p64和p53是病毒的逆转录酶、P31是病毒的整合酶。

在P64和P31基因重叠区内有一段序列，编码病毒的蛋白酶。

Env基因首先编码一个90多KD的蛋白质，经糖基化以后分子量增至160KD，这就是HIV包膜糖蛋白前体gp160，它在蛋白酶作用下被切割成gp120和gp41，前者称外膜蛋白暴露于病毒包膜之外，后者称跨膜蛋白，是插入病毒包膜脂质中的部分。

以上为HIV-1结构基因编码的蛋白，HIV-2结构基因编码的蛋白与HIV-1相似，只是分子量有一些差异，分别是，env基因编码gp140/gp105和gp36、gag基因编码p16和p26、pol基因编码p68/56和p32。

HIV-1和HIV-2的表面糖蛋白（gp160/gp120）和跨膜糖蛋白（gp41和gp36）、HIV-1的核心蛋白（p24）以及HIV-1的整合酶蛋白（p32）是最常用的制备HIV血清学诊断试剂的抗原。

2. 酶及其底物：
ELISA反应标记用的酶有多种，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、尿酶等，其中辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase HRP) 应用最广泛。

这种酶是从辣根菜中提取的，由糖蛋白和辅基（含铁血红素）构成，辅基为酶的活性中心，在403nm波长处有最大吸收峰，糖蛋白在275nm 波长有最大吸收峰，一般用A403nm与A275nm的比值代表酶的纯度（Reinheir Zahl RZ）。

用于酶免疫测定技术的HRP，其RZ值应大于3.0。

应注意酶的纯度不代表酶的活性，酶变性后，RZ不变但其活性下降。

HRP催化的底物为过氧化氢，常用的显色供氢体有邻苯二胺（OPD）和四甲基联苯胺（TMB）等。

OPD呈橙红色，难溶于水，测定波长为492nm，敏感性高，颜色稳定可维持数小时，对光敏感，使用前配制，反应过程须避光且有一定毒性。

TMB反应产物为蓝色，性质稳定，对人体无毒，选用各类酸性终止液，则会使蓝色转变为黄色，测定波长为450nm。

碱性磷酸酶（Alkaline Phospharase ALP）可从大肠杆菌或小牛肠粘膜中提
取，敏感性高，空白值低。

ALP的底物一般采用对硝基苯磷酸酯（pNPP），产物为黄色的对硝基酚，吸收波长是405 nm。

3. 阳性对照和阴性对照用血浆或血清
阳性对照（Positive Control）和阴性对照（Negative Control）是检验试验有效性的控制品，试剂盒都应设定阳性对照和阴性对照成立的条件，每次每板检测都应根据这个条件判断试验是否成立。

阳性对照和/或阴性对照也参与临界值的计算，作为判断结果的依据。

阳性和阴性对照应尽量与检测的标本同质，以人血清和血浆为标本的测定，对照品也应使用人的血清或血浆。

阳性对照应使用经多种试剂检测证实的HIV-1抗体阳性和HIV-2抗体阳性血浆或血清，由于HIV-2抗体阳性的人血浆或血清较难获得，HIV-2抗体的阳性对照可使用HIV-2抗原免疫的HIV-2抗体阳性的动物血浆或血清。

阴性对照应使用经多种试剂检测，确定为HIV抗体阴性的人血清或血浆。

4. 微孔板：
ELISA试剂使用的微孔板应该吸附性能良好、不参与化学反应、能使抗原或抗体保持免疫学活性、空白值低且透明度高、孔间差异小。

选择微孔板可采用以下方法：选出一份典型的阳性标本和典型的阴性标本，将它们进行一系列稀释，在不同的微孔板上按预定的ELISA操作步骤进行测定，在哪一种微孔板上阴、阳结果差别最大，哪种微孔板就是这一ELISA测定最适合的。

检验微孔板孔间差异的方法是：以一定浓度的人IgG（一般为10µg/L）包被微孔板各孔后，每孔加入适当稀释的酶标抗人IgG 抗体，按ELISA的操作步骤进行测定，计算平均OD值和变异系数（CV），要求批内CV应≤5%，批间CV应≤10%。

六、制备程序：
1. HIV抗原的制备和纯化：
可采用多种方法制备HIV抗原，包括基因工程方法原核或真核表达、合成多肽及病毒培养裂解等。

根据不同的抗原制备方法，采用适宜的方法进行纯化，如
层析法、超速离心等。

用非还原型SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法或其他方法测定抗原的纯度，采用抗原抗体结合实验鉴定抗原的活性。

用于包被的标记的抗原应该分子量正确、纯度高、活性好。

2. 酶标记抗原的制备：
酶标记抗原是酶免疫测定试剂盒的核心组成部分，通常试剂盒的有效期即是根据酶标记抗原的稳定性而定的。

因为在酶免疫测定试剂盒中，最易受外环境影响的试剂组分就是酶标记抗原。

酶标记抗原的质量也是影响试剂盒质量的重要因素之一。

因此，酶标记抗原的制备是ELISA试剂盒制备的关键环节。

酶标记抗原一般通过化学交联而得到的。

理想的化学交联方法应能得到分子组成明确、酶及抗原不失活、连接键稳定且经济的完全耦合的结合物。

酶—蛋白的耦合方法可分为三大类：①酶与蛋白的随机共价交联方法，如戊二醛方法；
②通过特定化学基团进行共价交联的方法，如过碘酸钠方法及采用各种均一和非均一双功能交联剂的方法；③通过非共价键交联的方法，如酶—抗酶免疫复合物方法。

这些方法各有优缺点，如戊二醛方法，由于交联的随机性，所得到的酶结合物大小不一，其中许多分子量很大，超过1 000kD，酶结合物中的酶活性与游离酶相比大大降低。

此外，大分子的酶结合物在免疫测定中还有可能形成影响测定的空间位阻。

使用过碘酸钠方法制备酶结合物，操作简单，所得到的酶结合物大小合适，酶的活性可以保持在80％以上。

过碘酸钠方法是Nakame和Kawaoi于1974年设计的极为有效的化学耦联方法，以后又有人对这种方法进行了改良，这种经过改良方法是目前用于HRP标记抗原最常用的方法。

方法的原理是：过氧化物酶的所有氨基首先用1—氟—2，4—二硝基苯（Sanger试剂）（DNFB）)不可逆地封闭，然后用NaIO4氧化过氧化物酶的糖链产生醛基和羧基，醛基与所加入蛋白的游离氨基形成Schiff碱，但不与已封闭的氨基作用，这种不稳定的氨基—羰基化合物可用硼氢化钠还原形成稳定的耦联产物。

这种方法大约会使70％的过氧化物酶和约99％的蛋白耦联。

每个蛋白分子最多可耦联5～6个过氧化物酶分子。

如要使每个蛋白分子结合一定比例的酶分子，可计算出理论上应加入到蛋白中的活化的过氧化物酶的量。

3. 包被抗原板的制备：
固相的抗原或抗体称为免疫吸附剂，将抗原或抗体固相化的过程称为包被(coating)。

以聚苯乙烯微孔板为载体，包被方法是：将抗原或抗体溶于缓冲液（最常用的为pH9.6 的碳酸盐缓冲液，也可用pH7.2的磷酸盐缓冲液及pH7~8的Tris-HCL缓冲液）中，加入微孔板孔中在4℃过夜后甩弃孔内液体，用洗涤液清洗，也可37℃保温2小时进行包被。

封闭（blocking）是继抗原或抗体包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。

抗原或抗体包被时蛋白的浓度较低，固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而避免在加入标本和酶结合物时干扰物质的吸附，减少非特异反应。

封闭的程序与包被类似，最常用的封闭剂是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明胶的。

不是所有的ELISA微孔板都需要封闭，有时封闭不当反而会使本底增高。

一般说来，双抗体夹心法，只要酶标记物活性高、操作时洗涤彻底，不封闭也可得到满意的结果，特别是用单抗腹水直接包被时，因其中大量非抗体蛋白在包被时也吸附在固相表面，已起到了封闭剂的作用。

但在间接法ELISA测定中，封闭一般是不可少的。

包被好的ELISA微孔板干燥真空锡袋包装，低温保存。

4. 阳性对照和阴性对照的制备：
选用经多种试剂检测确定的HIV抗体阳性和HIV抗体阴性的人血浆或血清，为了消除HIV抗体阳性血浆中HIV可能导致的生物安全危险，应将HIV抗体阳性血浆或血清60℃加热1小时，灭活HIV，操作时应注意先将血浆或血清用生理盐水对倍稀释后再加热，以免蛋白凝固。

为了避免单份HIV抗体阴性血浆或血清可能存在影响检测特异性的因素，阴性对照应选用5份以上的人血浆或血清，用摇床充分混合。

为了避免细菌在人血清和血浆中繁殖，导致阳性和阴性对照混浊并影响检测结果，一般在血清或血浆中加入防腐剂，并用0.22µM的微孔滤膜过滤除菌，于2～8℃保存。

5. 反应时间的设置：
抗原抗体反应在液相中可以很快达到平衡，但是在ELISA测定中，由于抗
原或抗体包被在固相的表面，抗原抗体反应只能在固相表面附近进行，远离固相表面的抗体或抗原要靠浓度差的改变缓慢地参入反应，在37℃条件下需要1～2小时才能达到反应平衡。

为了使抗原抗体充分反应、试剂盒达到最大程度的敏感性，要求加入标本后反应时间不低于60分钟、加入酶结合物后反应时间不低于30分钟、加入显色液后反应时间不低于30分钟。

七、检定
1. 国家参考品
国家生物参考品系指用国际参考品标定的、我国自行研制的用于微生物或其产物的定性鉴定或疾病诊断的生物试剂、生物材料或特异性抗血清，或是用于定量检测某些制品生物效价的参考物质。

HIV抗体检测试剂的国家参考品是由中国药品生物制品检定所研制的、用于评价或验证HIV抗体诊断试剂检测结果的准确性和精密度、从而对试剂盒进行质量控制的血清盘。

国家参考品的制备与标定应符合“生物制品国家标准物质制备和标定规程”的要求，并由国务院药品监督管理部门指定的机构分发。

企业工作标准品或参考品必须经国家标准品或参考品标化后方能使用。

我国第一代HIV抗体国家参考品于1994年研制成功，在1994年~1996年间使用，对我国HIV抗体酶联免疫试剂的早期研制及促进其质量提高起到了重要作用。

受样品来源的限制，第一代国家参考品中所用的阳性样品大部分购自国外，且没有自然弱阳性样品。

1995年，以第一代HIV抗体国家参考品为基础，研制了第二代国家参考品，在1996年~2000年期间使用。

从国内2000多份血浆中筛出HIV抗体自然弱阳性血浆15份（其中3份为中等强度以上反应性），保留第一代参考品中3份人工稀释的低反应性血浆及2份抗HIV-2型抗体阳性血浆，共20份为阳性参考品；阴性参考品包括HIV抗体阴性血浆20份；另外还包括1份精密度参考品。

与第一代国家参考品相比，第二代参考品以国内自然弱阳性标本为主，能够更准确地考核试剂盒的灵敏度，也对试剂盒提出了更高的要求。

第三代国家参考品于2000年研制完成，自2001年开始使用。

其组成包括20份阳性参考品（18份HIV-1型阳性、2份HIV-2型阳性）、20份阴性参考品、6份
最低检出限参考品及1份精密度参考品。

第三代国家参考品在充分保证第一代和第二代国家参考品的优势的基础上，在阳性参考品中增加了阳性反应特别强的两份样品（P11和P12），其吸光值均在2.0以上，在质量标准中规定P12的吸光值必须大于或等于P11，且P11和P12的吸光值均应大于2.0，以评价试剂是否存在hook 效应。

而且，第三代国家参考品中的绝大部分阳性参考品进行了基因型分析，选择的样品包括了我国流行的主要基因型，即B’亚型、BC重组型和AE重组型。

评价灵敏度的最低检出限参考品是采用亲和层析法制备的纯化的抗gp160抗体，并对其进行倍比系列稀释，对提高HIV抗体诊断试剂的灵敏度起到了决定性作用。

2. 最低检出限
用亲和层析方法从HIV抗体阳性血清中纯化出gp160抗体，用HIV抗体阴性血清稀释，制备成HIV-1gp160抗体阳性血清，然后进行系列稀释，根据多数试剂盒检测的结果，选择5份系列稀释的样品及1份稀释血浆，作为最低检出限参考品，评价试剂盒检出gp160抗体的最大稀释度，判断某种试剂的最低检出限是否合格。

3. 精密性
精密性（precision）是监测测定值有无良好的重复性和再现性的指标。

精密性以监测数据的精密度表征，是使用特定的分析程序在受控条件下重复分析均一样品所得测定值之间的一致程度。

它反映了分析方法或测量系统存在的随机误差的大小。

测试结果的随机误差越小，测试的精密度越高。

精密度通常用极差、平均偏差和相对平均偏差、标准偏差和相对标准偏差表示。

考察试剂盒精密度的指标一般是变异系数（CV%）。

4. 稳定性：
指试剂盒经历外界环境变化保持原有检测性能的能力，稳定性试验的目的是考察试剂盒的性能在温度、湿度、光照等条件下随时间变化的规律，为设置试剂的生产、包装、储存和运输条件提供科学的依据，也是确定试剂盒有效期的依据。

稳定性试验包括影响因素试验、加速破坏试验和实时稳定性试验。