细胞培养技术进阶教程

低温保护剂的应用
• 常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透 性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对 水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程， 能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在 胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少 冰晶对细胞的损伤。
细胞冻存方法
• 1、预先配制冻存液： 含20%血清培养基10% DMSO
• 培养基保存于4°C 冰箱中， 培养基内之CO2 会 逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基 中之酸碱指示剂(通常为phenol red) 的颜色也会 随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果，将 造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，可 以通入无菌过滤之CO2，以调整pH 值。
形态学鉴定
细胞膜结构改变分析
• 胞膜通透性增加：改变细胞对一些核染料物质 （ DAPI、Hoechst 、 PI ）的通透性，利用着色 结果的差异区别检测坏死和凋亡细胞 • 膜内侧磷脂酰丝氨酸（PS）外翻到膜表面： Annexin V法 •常用方法有：DAPI、Hoechst、 PI单染、 Heochst/PI双染、Annexin-V/PI双染等。
•利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞进 行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细
胞分析技术。
流式细胞仪工作原理
经荧光染色的细胞从喷嘴中高速喷出，通过一个聚焦的光源进而通过 各种光敏元件测量这些细胞发射的散射光和荧光，经计算机处理得到 多种信息参数
信号检测--散射光
5、细胞活力检测
• 在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细 胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活
力。
• 应用：由组织中分离细胞 复苏后的细胞 药物筛选
• 方法：细胞计数+台盼兰染色
•
MTT法
（1）细胞计数
• 将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖 片盖在计数板上。
• 将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘， 使悬液充满盖片和计数板之间。
操作流程：
细胞接种96孔板（ 200ul，103-104 /孔） 贴壁后加处理因素
加入MTT 20 ul （5mg/ml）,培养4 h 吸出培养液，加入DMSO150ul,摇床震荡10 min
酶标仪检测0D值（波长490nm）Biblioteka Baidu
注意事项
1. 选择适当的细胞接种浓度，保证细胞培养结束时浓度不至 于过满
– 冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90％， 无微生物污染。细胞浓度控制在：1×107－ 5×107/ml。
细胞复苏方法
• （l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～ ~38 ℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。
• （2）5分钟内用培养液稀释至原体积的5-10 倍以上。
• （3）低速离心10分钟。 • （4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的
• 7. 将后者放入培养箱中培养。
4、细胞冻存、复苏和运输
冻存和复苏的原则：慢冻快融
• 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水， 细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。
• • 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的
冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的 损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大 冰晶，即冰晶的重结晶。
却明显变缓。
细胞培养的污染和检测
• 细胞污染的种类 细菌、酵母菌、霉菌和病毒 • 污染源 无菌操作技术不当 操作室环境不佳 污染之血清 污染之细胞
细菌培养液被洋葱佰克霍尔德菌污染了。 洋葱佰克霍尔德菌（Burkholderiacepacia）原属假单胞菌 属，是植物病原菌。
白色念珠菌污染
真菌感染
2. 种板技术：均匀 3. 实验时应设置调零孔，溶媒孔，加药孔。 • 调零孔：培养基、MTT、DMSO。（无细胞） • 溶媒孔：培养液、MTT、DMSO、细胞、溶酶 • 加药孔：培养液、MTT、DMSO、细胞、不同浓度的药
物 （一般5-7个梯度，设3-5个复孔） 3. 避免血清干扰：一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。 4. 边缘效应：周边孔加入PBS
6、细胞周期检测
细胞周期:细胞每一次分裂增殖的周期 •流式细胞术PI染色
流式细胞术PI染色检测细胞周期
• 原理：碘化丙锭（PI）可与细胞内DNA 和RNA 结合,采 用RNA 酶将RNA 消化后,通过流式细胞术检测到的与 DNA 结合的PI 的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量 的多少。
• 通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA 含量进行检测时, 可以区分细胞周期各时相：
细胞培养技术进阶
细胞培养技术
1、细胞原代培养 2、细胞生长状况的观察 3、细胞传代 4、细胞冻存、复苏和运输 5、细胞活力检测 6、细胞周期检测 7、细胞凋亡检测 8、细胞凋亡的流式分析
1、细胞原代培养
• 原代培养也叫初代培养，是从供体取得组 织细胞后在体外进行的首次培养。
• 1、取材 • 2、漂洗 • 3、剪切 • 4、消化 • 5、过滤 • 6、清洗 • 7、计数 • 8、接种
前散射光（FSC)与细胞的大小有关 侧散射光(SSC)反映细胞内的颗粒 多少
信号检测--荧光信号
X轴：代表荧光信号或散射光信号的强度，用“通道数”表示 ，与光强度之间线性关系或对数关系 Y轴：代表该通道内所出现具有相同光信号特征性细胞的频率
流式细胞仪检测细胞凋亡常用的三种方法
（一）PI单染色法 （二）Heochst 33342/PI双染色法 （三）Annexin V/PI双染色法
• G1/ G0 期具有二倍体细胞的DNA 含量 • G2/ M 期具有四倍体细胞的DNA 含量(4N) • S 期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间
• 应用：通过流式细胞仪分析各时期的细胞百分数，可检测 细胞的增殖周期。
增加膜通透性 消化RNA
7、细胞凋亡的检测
凋亡形态学特征
●细胞体积变小，胞质浓缩。 ●胞膜结构完整，有泡状突起。 ●核染色质浓缩，聚集核膜周围。 ●细胞膜内陷形成凋亡小体 (Apoptotic bodies)。 ●无内容物外溢，因而不引起周围的炎症反应。
• 2、取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量 冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1×106 ～ 5 ×106细胞/ml)
• 3、加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细 胞名称和冷冻日期。
冷冻保存要点：
– 冷冻过程要缓慢。4℃ 30－60 分钟→-20℃ 30 分钟 →-80℃ 16－18 小时（或过夜）→ 液氮长期保存
PI（Propidium Iodide, 碘化丙啶 ）
• 是一种常用的细胞核荧光染色剂。 • 它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚
期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而 将细胞核染红 • 将Annexin-V、Heochst与PI匹配使用， 就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区 分开来
Heochst/PI双染
Annexin V/PI双染色法
Annexin V/PI双染色法
• 左下象限:活细胞， 为（FITC-/PI-）；
• 右上象限:坏死细胞 （FITC+/PI+）
• 右下象限:凋亡细胞 （FITC+/PI-）
细胞培养常见问题解答：
3、为何培养基保存于4 °C 冰箱中， 颜色会偏暗红 色， 且pH值会越来越偏碱性？
(3) 四唑盐（MTT）比色法
• 四唑盐（MTT）：噻唑蓝 • 原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原
成不溶干水的蓝紫色产物，并沉淀在细 胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚 砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫 色结晶物，溶液颜色深浅与活细胞数成 正比。 • 优点：简单快速、灵敏、经济 • 应用:新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放 射敏感性实验等。
• 一般生长稳定的细胞需要2-3天换液1次，生 长慢的细胞需要3-4天换液一次。原代细胞 换液通常每周两次，每次换半量或1/5-1/3 量。原代细胞第1次换液时，切记不要把培 养液全部倒掉。
(2)细胞系(株)换液:
• 条件合适时生长迅速，过夜就变黄，可进 行全量换液。这种情况下，最好减少细胞 接种数，延长换液的时间。
支原体污染电镜照片, 煎蛋状和其他形状
3、细胞传代（贴壁细胞）：
• 1. 吸光培养瓶中的培养液 • 2.加入0.5-2 ml 0.25％的胰蛋白酶液(以消化液
能覆盖整个瓶底为准），然后两种方式处理： 一种30S后，吸去消化液，剩余的酶液继续作 用，后在相差显微镜下观察。第二种，不吸去 消化液，静置2-10 min（显微镜下动态监测）。
细胞。
细胞运输：
• （1）长距离运输（几天） • 选择生长良好细胞，换细胞液，补充新培养液至
瓶颈部，保留微量空气，拧紧瓶盖， • 瓶子口用胶密封，并用棉花包，放在携带者贴身
口袋带回，或用包装盒空运。 • （2）短距离运输（几小时） • 去掉大部分生长液，仅留少量液体覆盖单层细胞，
防止细胞干燥，将细胞附着面朝上带回。 • （3）液氮冻存运输
• 在倒置镜下观察被消化的细胞，如果胞质回缩，细胞 变圆，相互之间不再连接成片.
• 3. 吸去胰蛋白酶液，加入含血清的培养液。
• 4. 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁 细胞，形成细胞悬液(按顺序)。然后离心沉 淀细胞。
• 5. 吸取1:2-5细胞悬液，接种于新的培养瓶 内。
• 6. 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的 新培养瓶内。
（2）台盼兰排斥染色
原理：死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见兰色的细胞， 活细胞不被染色，呈透明状。
步骤： • 制备单细胞悬液，并适当稀释（105/ml） • 9滴细胞悬液+1滴0.4%台盼兰染液，混匀染色。 • 吸取少许悬液涂于计数板上。 • 3分钟内计数活细胞和死细胞
细胞数/ml＝（4大格细胞数之和/ 4 ）×104×稀释倍数 细胞活力（％）＝未着色细胞数÷总细胞数×100％
凋亡细胞膜通透性增高，Hoechst荧光（蓝色）强度增高 PI不能进入细胞膜完整的活细胞中：正常细胞和凋亡细胞拒染，坏死细胞由 于失去膜完整性可染（红色）。
磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）
• 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）在细胞凋亡 的早期可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面
• 方法:
2、细胞形态变化：
• 生长良好细胞：透明度大，折光性强，轮 廓不清。
• 生长状态不良时，细胞折光性变弱，轮廓 增强，胞质中常出现空泡，脂滴，颗粒样 物质，细胞之间空隙加大。
3、微生物污染：
• 培养液颜色与透明度： • 培养液混浊，液体内漂菌丝或细胞菌。 • 支原体污染，没有明显症状，但细胞生长
• 静置3分钟。 • 镜下观察计数
细胞浓度的计算：
• Volume (体积) • =長 x 寬 x 深度 • = 1 mm x 1 mm x 0.1 mm • = 0.1 mm3 • = 1 x 10-4 cm3 (ml)
• 细胞密度(个/mL) = 4个大方格的 细胞总数/4 ÷10-4
• =4个大方格的细胞总数/4 ×104
• Annexin-V是一种Ca2 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高 亲和力特异性结合。
• 将Annexin-V进行荧光素（FITC）或biotin标记，利用 流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
Annexin V/PI双染色法
8、细胞凋亡的流式分析
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）:
2、细胞生长状况的观察
培养细胞生长状况常规检查
• 1、培养液：颜色与透明度的变化 • 2、细胞生长状况。 • 3、细胞形态变化。 • 4、微生物污染。
1、培养液PH值（颜色变化）
• 变黄，表示PH值下降，细胞生长旺盛，代 谢产生的酸性物不断积累导致。
• 变红或紫红色，表示PH值上升，细胞生长 停滞、死亡。
DAPI
• DAPI是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料。 • 与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱
基区
Hoechst 染色
• Hoechst为膜通透性核酸染料， • DNA结合型荧光染料,可以嵌合到碱基分子 • 能进入正常细胞，凋亡细胞的胞核会呈致密浓染，或
呈碎块状致密浓染
凋亡细胞
PI单染色法
Heochst 33342/PI双染色法
• 凋亡细胞膜通透性增高，Hoechst 33342 荧光（蓝色）强度增高
• PI不能进入细胞膜完整的活细胞中：正常细 胞和凋亡细胞拒染，坏死细胞由于膜完整性 可染（红色）。
区别正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞：
正常细胞：低蓝光/低红光 凋亡细胞：高蓝光/低红光 坏死细胞：高蓝光/高红光