基于纳米金的电化学DNA生物传感器的研究进展_耿美

基于纳米金的电化学DNA生物传感器的研究进展
耿美，李忠海*，黎继烈，黄闪闪，郭筱兵
中南林业科技大学食品科学与工程学院（长沙 410004）
摘要简单介绍了电化学DNA生物传感器的组成及原理, 综述了近年来单链DNA(ssDNA)的固定和交杂的指示及基于纳米金的电化学DNA生物传感器在食品安全检测方面的应用与研究进展, 分析了其在食品应用中存在的问题, 并对今后的研究重点提出一些看法。

关键词纳米金; 电化学DNA生物传感器; 食品安全检测
Progress on DNA Electrochemical Biosensor Based Au Nanoparticles Geng Mei, Li Zhong-hai*, Li Ji-lie, Huang Shan-shan, Guo Xiao-bing Central South University of Forestry and Technology Academy of Food Science and Engineering
(Changsha 410004)
Abstract A brief introduction of composition and principle of electrochemical DNA biosensor was given and the research progress of immobilization of single-strand DNA, indicator of hybridization and the application of DNA electrochemical biosensor based Au nanoparticles in the food safety inspection in recent years were summarized. Some problems and direction of research in the application of the biosensor in food safety inspection were mentioned.
Keywords Au nanoparticles; electrochemical DNA biosensor; food safety inspection
DNA是生物的主要遗传物质，而且对于每一个生物体来说，核酸的序列都是独一无二的。

因此通过检测生物的核酸序列，可以确定是否有该生物的存在。

随着人类基因组计划的实施，DNA生物传感器也应运而生。

在生物传感器中，电化学生物传感器有由于制作简单、灵敏度高、重现性好、成本低、选择性好、可用于活体检测和易于实现微型化等优点而被广泛应用。

纳米金由于制备过程简单，粒径可控，具有很好的生物相容性、高的比表面积和高的表面能，容易与DNA结合而被引入到电化学检测领域。

核酸功能化的金纳米颗粒也逐渐成为了一种新颖的电化学信号放大装置，同时传感器是纳米微粒最有前途的应用领域之一[1]。

因此，简单介绍了DNA电化学生物传感器的组成及原理，综述了近年来ssDNA的固定和交杂的指示及基于纳米金的DNA电化学生物传感器在食品安全检测方面的应用与研究进展，分析了其在食品应用中存在的问题，并对今后的研究重点提出一些看法。

1 DNA电化学生物传感器的设计
电化学DNA生物传感器可以分为两类：一类是基于DNA杂交的电化学生物传感器，它是在电极表面固定单链DNA作为探针，实现对探针互补DNA的检测。

另一类则是非基因识别的电化学DNA传感器，它是在电极表面固定单链或双链DNA作为传感器的敏感器件，利用其它物质与DNA的作用或者利用DNA的特性来实现对特定物质的检测和研究。

电化学DNA杂交生物传感器是将ssDNA分子作为敏感元件固定在电极表面，利用分子杂交技术与目标DNA杂交，通过测定电活性物质杂交前后的电化学信号变化来确定目标DNA 的序列[2]。

检测包括4个步骤：ssDNA的固定，杂交过程，杂交的指示和电化学信号检测。

其中ssDNA的固定和杂交的指示是电化学传感器的两大关键问题[3]。

电化学信号以电流、电压、电导、或电化学阻抗的方式进行检测[4]。

1.1 ssDNA的固定
ssDNA的固定是构建电化学DNA传感器的首要问题。

固定的ssDNA必须满足稳定、性质不改变、有适当的空间取向及空间位阻不影响目标DNA接近[5]。

纳米金在ssDNA固定方面的应用是首先将纳米金固定在电极表面，再在纳米金表面固定ssDNA。

金纳米增加ssDNA固定量，进而提高灵敏度。

纳米金在电极上固定的方法有电化学沉积法和利用巯基或氨基的化学吸附法。

ssDNA的固定方法有吸附法、共价键合法、自组装法和生物素-亲和素法等。

1.1.1 吸附法
吸附法是将ssDNA直接滴涂或在一定电位下吸附在电极表面。

Abruna等[6]在金的微电极表面滴上ssD-NA，自然晾干后用水洗去多余的DNA，进而把ssDNA 来固定在电极表面。

周忠亮等[7]先将纳米金修饰在玻碳电极表面，再在0.5 V的电位下吸附固定DNA。

缪谦等将2-氨乙基硫醇固载到玻碳电极表面，进而化学吸附纳米金，并在纳米金上在一定电位下固载ssDNA。

*通讯作者；基金项目：质检公益性行业科研专项
（201210036）
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该方法简单，易操作，不需要什么特殊的试剂，也不需要对ssDNA进行衍生化，但固定的ssDNA易脱落，稳定性不够，DNA无序固定，多点结合甚至DNA 可能平躺在电极表面导致固定量少，对分子识别过程也有一定影响，且该方法易扭曲DNA的结构，造成固定DNA的无法接近和不正确杂交。

1.1.2 共价键合法
首先将电极表面进行预处理，产生活性功能基团并进行表面的有机合成，同时使核苷酸衍生化带上合适的功能团，然后在双官能试剂或偶联活化剂的作用下使电极表面的功能基团与衍生化的ssDNA发生共价键和作用，从而把ssDNA固定在电极表面。

常用的双官能试剂和偶联活化剂有戊二醛、乙基-（3-二甲基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基磺基琥珀酰亚胺（NHS）等。

由于碳质电极表面容易进行处理产生功能团，此方法常用碳质电极作为基体电极。

孙星炎等将石墨电极表面预处理产生-NH
2基，在EDC的作用下，将ssDNA共价键和在电极上。

徐桂云采用电化学氧化法使玻碳电极表面生成羧基，以EDC和NHS为偶联活化剂，分别把乙二胺和乙二醇引入电极表面作为手臂分子，延长的活性中心氨基或羟基在EDC 存在下可进一步有效地共价固定DNA。

张怀等[8]在EDC 和NHS偶联活化剂的作用下，
将末端带有-NH
2
的ssDNA共价键和在单壁碳纳米管电极上。

此法固定ssDNA稳定性好，杂交活性高，易于再生，灵活性高而且固定的DNA链有更好的方向性，但由于电极表面活性位点有限，表面合成又是异相反应，因而固定的DNA量有限，响应信号小，而且步骤繁琐，耗时。

1.1.3 自组装法
即基于分子的自组作用，在电极表面自然形成高度有序的单分子层膜的方法。

此方法一般应用在金电极上ssDNA的固定，因为巯基化合物的巯基与金电极形成Au-S键，形成自组装膜。

利用Au-S键的自组装有两种方法：一种是将DNA链端巯基化，再通过-SH 在Au表面的自组装作用制备DNA修饰电极；一种是在Au电极表面形成特殊官能团的巯基自组装单分子层，再共价键合或吸附DNA制备修饰电极。

目前用的较多的是将巯基修饰的探针ssDNA通过自组装的方法固定在金电极的表面，并用巯基乙醇（MCH）对其进行封闭。

由于巯基乙醇中的羟基带负电荷，与同样带负电荷的DNA磷酸骨架有排斥作用，使DNA链以一定角度直立在电极表面。

与其他方法相比，此方法简单易得，稳定性好，有利于杂交，性质多样化，具有更好的稳定性和化学结构，氧化还原活性，还可以预期膜的结构表面结构高度有序，可以使DNA骨架在空间构型上有很大的自由度，有利于碱基暴露和双螺旋结构的形成[9]。

它是目前较理想的方法，但对巯基化合物修饰的DNA的纯度要求较高，分离提纯操作较烦琐而且Au-S键的热力学稳定性较差，最高承受温度只能达到80 ℃左右。

1.1.4 生物素-亲和素法
此方法利用生物素与亲和素的结合具有专一、迅速和稳定的特点。

一般先把亲和素通过共价偶联或静电作用固定在电极表面，再将末端修饰了生物素的DNA探针与其进行特异性偶联。

王保珍等[22]通过直接吸附将亲和素固定在铂电极表面，再通过生物素与亲和素的作用将生物素标记的DNA探针固定在铂电极上。

Polsky等[10]在玻碳电极上固定修饰了生物素的磁珠，进而把标记有亲和素的探针固定在磁珠上。

这种固定方法稳定性好，操作简单，而且对电极材料具有很宽的选择性。

但亲和素表面具有带正电荷的赖氨酸或精氨酸，与DNA的负电荷骨架会形成非特异性吸附。

1.2 杂交的指示及电化学转换
根据是否需要电化学活性物质作为杂交指示剂，电化学生物传感器分为无需杂交指示剂电化学生物传感器和基于杂交指示剂电化学生物传感器。

1.2.1 无需杂交指示剂电化学生物传感器
无需杂交信号即直接检测有核酸杂交引起的电信号的改变。

最常用的是DNA碱基中具有电活性的鸟嘌呤的电信号的改变。

利用的原理是鸟嘌呤具有电化学活性，容易发生氧化反应，当双链DNA形成时，双螺旋外侧的脱氧核糖阻碍内侧碱基的电化学反应，使G的电信号下降。

所以可以通过G的电信号变化检测DNA杂交。

但G的氧化是不可逆的，杂交前G发生氧化反应会对杂交及检测产生影响；由于DNA本身的电化学信号较弱，所以此方法较少使用。

1.2.2 基于杂交指示剂电化学生物传感器
根据杂交指示剂与核苷酸的作用不同，杂交指示剂可分为非标记型指示剂和标记型指示剂。

1.2.2.1 标记型
非标记型指示剂是一类具有电活性的小分子物质，由于其以不同的结合能力与ssDNA和dsDNA结合，进而判断DNA杂交是否发生和杂交程度。

非标记型指示剂与DNA分子的作用一是通过分子嵌入dsDNA 双螺旋的碱基之间，二是通过分子与DNA骨架上的带负电磷酸基团之间的静电作用。

常用的嵌入式的有过渡金属金属螯合物（如[Co(phen)-
3
]2+），静电作用的有机染料（如亚甲基蓝）和小分子药物（如道诺霉素）等。

非标记性指示剂不需要繁琐的标记过程，使检测时间大大缩短，提高检测效率，但由于其能同时与ssDNA和dsDNA作用，且很容易与dsDNA分开，故其
选择性较差、灵敏度也受影响。

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1.2.2.2 标记物
标记物法是把电活性物质直接标记在DNA链上。

基于标记物检测的电化学传感器分为两类：（1）基于杂交改变分子构象。

电活性物质标记于DNA探针上，通过与目标杂交，影响探针结构，改变电活性物质与电极表面的距离，可引起电化学信号的变化从而实现目标的检测。

（2）通过与目标作用将标记了电活性分子的探针从溶液中捕获到电极表面的DNA电化学传感器。

何品刚等[11]将二茂铁标记在小牛胸腺DNA上制得的DNA电化学探针具有很好的重现性和稳定性。

纳米金作为标记物也广泛应用在DNA检测中。

利用胶体金颗粒标记DNA，通过检测金标粒子的氧化还原信号检测DNA杂交情况。

这种电化学检测方法将纳米技术、核酸杂交技术与电化学技术有机地结合起来。

标记法在灵敏度和选择性上有一定的优势,但标记过程较复杂，标记物对DNA的活性可能产生一定影响。

1.2.2.3 纳米金标记与电化学活性物质的联用
纳米金标记与电活性物质的联用，通过测定电化学物质的电信号变化来检测目标DNA，纳米金标记使信号增大。

Song等[12]利用将带有巯基的捕获探针修饰到金电极上，用巯基乙醇封闭，当有目标DNA存在的情况下，目标DNA会被捕获DNA捕获，同时带有巯基、修饰的金纳米粒子的报告探针与目标DNA形成双链，形成三明治体系。

通过测定非标记物六氨化钌（[Ru(NH
3
)6]3+）的电信号来实现目标DNA的检测，金纳米粒子的存在使固定的报告探针增多，进而使电信号增强。

2 基于纳米金的电化学DNA传感器在食品安全检测方面的应用
基于纳米金的DNA电化学生物传感器广泛应用于特定基因检测、基因损伤及疾病的诊断与预防方面，但应用在食品领域还处于初级阶段。

目前，在食品方面的应用主要是食品中病原菌的检测、重金属中Hg2+的检测和转基因食品的应用。

2.1 在病原菌检测方面的应用
食品中的营养物质充足，很容易被一些微生物污染。

因此检测食品是否被微生物污染，是食品安全检测中的一个重要部分。

通过检测病原菌的特征基因来检测是否有病原菌的存在。

罗贵华等[13]利用自组装法，将5’端巯基修饰的李斯特菌的ssDNA固定在金电极上，然后与纳米金标记的探针进行杂交，实现对李斯特菌DNA的检测。

Li等[14]在金纳米多孔膜电极上固定巯基修饰的寡核苷酸片段，再用MCH进行封闭，从而制备了SH-DNA/MCH混合自组装单层膜修饰金电极。

以亚甲基蓝为杂交指示剂，采用差分脉冲伏安法，实现了对大肠杆菌DNA的检测。

对大肠杆菌进行
浓缩和预培养可以进一步提高其检测灵敏度。

经过5 h 的培养，该传感器能检测出50 cfu/mL的大肠杆菌。

该检测方法能有效地检测病原菌，与传统的培养检测相比，节省时间，价格低廉，具有很高的选择性、灵敏度和重现性，在饮用水和食品安全检测中有广阔的应用前景。

2.2 在重金属Hg2+检测方面的应用
随着工业的高速发展，水质污染日益严重，因此对水产品中的重金属进行检测是十分必要的。

吴会旺[15]在1,6-二巯基己烷处理的金电极上引入纳米金，在纳米金上固定捕获探针，用巯基乙醇进行封闭，一条与汞离子特异结合的探针与电极表面固定的探针杂交。

在汞离子存在的情况下，T与T之间会形成稳定的T-Hg2+-T，使得探针发生折叠，形成发卡结构。

由于双链中互补的5个碱基对不足以形成稳定的结构，探针从捕获探针脱离，电活性嵌入剂—亚甲基蓝减少导致电流信号减弱，间接的对Hg2+进行检测。

Kong等[16]利用T对Hg2+的特异性键合能力，在Hg2+存在时，捕获探针与其含有T-T错配的互补探针形成双链，通过测定嵌入剂亚甲基蓝的电信号变化来检测Hg2+。

刘雪平[17]以亚甲基蓝作为杂交指示剂来定量检测Hg2+的线性范围为1~500 nmol/L，检测限为0.32 nmol/L。

该方法具有灵敏度高、选择性好，能用于实际样品中汞离子的检测。

能检测水相中的汞离子。

与传统的检测汞离子的技术相比，传感器的使用不需要先进的仪器设备和对样品预处理，检测过程简单、成本低，因此该传感器应用在实际检测中具有很大的优越性。

2.3 在转基因食品检测方面的应用
随着转基因食品进入人们的餐桌，其安全性引起广泛关注。

转基因原材料通常含有特定的启动子、终止子、标记基因等，它们来源于微生物，是非转基因植物所没有的。

故只要检测食品中是否存在启动子、终止子和标记基因等就能判断出是否为转基因食品。

转基因食品中常用的启动子和终止子有花椰菜花叶病毒35S启动子（CaMV 35S）和根癌农杆菌终止子（NOS）DNA片段。

CaMV 35S启动子基因或NOS终止子基因的检出从某种程度上就可以肯定该样品来源于转基因植物。

Daming等[18]在碳电极表面修饰一层纳米金膜，花椰菜花叶病毒的启动子作为目标ssDNA固定在纳米金表面，与标记CdSe量子点的捕获探针杂交，然后用HNO
3
溶解CdSe，通过测定Cd2+的电信号从而成功的检测花椰菜花叶病毒的启动子，检测范围是5.0×10-12~5.0×10-7 mol/L，检出限为6.5×10-13 mol/L。

王学亮等[19]用聚硫堇修饰的玻碳电极吸附纳米金粒
子，然后在纳米金表面固定ssDNA，在[Fe(CN)
6
]3-/4-
溶
119
液中实现对转基因植物外源基因草丁膦乙酰转移酶基因（PAT）的检测。

Yang等[20]利用相同的方法，通过聚2,6-吡啶二甲酸修饰的玻碳电极依次固定纳米金和探针DNA实现对PAT的检测。

由于深加工的食品，其DNA大部分会被降解，所以利用DNA传感器检测转基因食品主要适用于转基因作物原材料和原材料初加工食品。

3 结语与展望
基于纳米金的DNA电化学生物传感器集于纳米金和DNA电化学生物传感器的优点，而且纳米金在一定条件下使DNA对酸、碱及高温的耐受能力增强，同时该传感器不破坏样品，不受样品颜色的影响。

但其用于食品安全检测还处于初级阶段，还存在需要解决的问题。

首先，该传感器只局限于特定基因和与DNA有相互作用的物质的检测，如在食品方面，主要在病原菌、转基因食品及重金属Hg2+检测，而还不能用于抗生素、农药残留、毒素、其它重金属和食品添加剂等的食品安全检测。

其次，目前，基于纳米金的DNA电化学传感器还处在实验阶段，主要集中在传感器的研制、制备，真正商业化的产品还不多，也很少用到实际样品的检测中。

所以，今后在食品安全检测方面的研究重点：进一步研究食品中有毒有害物质对DNA的影响，以拓宽传感器在有毒有害物质检测方面的应用；提高传感器的灵敏度、保证稳定性、降低其检测成本及使其检测范围达到或高于国家标准以用于实际样品的检测。

参考文献：
[1] WANG J, MENG W Y, ZHENG X F, et al. Combination
of aptamer with gold nanoparticles for electrochemical signal amplification: application to sensitive detection of platelet-derived growth factor [J]. Biosens. Bioelectron, 2009, 24: 1598-1602.
[2] Sassolas A, Leca-Bouvier B D, Blum L J. DNA biosensors
and microarrays [J]. Chem Rev, 2008, 108: 109-139.
[3] 杨丽菊, 彭图治. 特定序列脱氧核糖核酸电化学生物传感
器进展[J]. 化学分析, 2001, 29(3): 355-360.
[4] LAO R J, SONG S P, WU H P, et al. Electrochemieal
interrogation of DNA monolayers on gold surfaces [J]. Anal Chem, 2005, 77: 6475-6480.
[5] 聂立波. 几种基于纳米金标记的DNA传感器的研究[D].
南京: 东南大学, 2005.
[6] PANG D W, Abruna H D. Micormethod for the
investigation of the interactions between DNA and red3ox-active molecules [J]. Anal Chem, 1998, 7(15): 3162-3169. [7] 周忠亮, 郭秀锐, 鲁理平, 等. DNA-纳米金修饰玻碳电极
用于水中甲醛的测定[J]. 分析测试报, 2009, 28(6): 697-
700.
[8] 张怀, 张云怀, 李静, 等. DNA共价修饰的单壁碳纳米管电
极的制备及与VB6相互作用研究[J]. 分析测试学报, 2008, 27(8): 830-834.
[9] 张炯, 万莹, 王丽华, 等. 电化学DNA生物传感器[J]. 化学
进展, 2007, 19(10): 1576-1584.
[10] Joseph Wang, Danke Xu, Abdel-Nasser Kawde, et al. Metal
Nanoparticle-based electrochemical stripping potentiometric detection of DNA hybridization [J]. Anal Chem, 73(2001): 5576-5581.
[11] 徐春, 蔡宏, 何品刚, 等. 二茂铁标记DNA电化学探针
的研制及性质研究[J]. 高等学校化学学报, 2001, 22(9): 1492-1495.
[12] Zhang J, Song S P, Zhang L Y, et al. Sequence-specific
detection of femtomolar DNA via a chronocoulometric DNA sensor(CDS): effects of nanoparticle-mediated amplification and nanoscale control of DNA assembly at electrodes [J]. Am Chem Soc, 2006, 128: 8575-8580.
[13] 罗贵华, 徐怀德, 高志贤, 等. 纳米金标记DNA的生物传
感器[J]. 解放军预防医学杂志, 2007, 25(2): 91-93.
[14] Li K, Huang J J, Shi G Y, et al. A Sensitive Nanoporous
Gold-Based Electrochemical DNA Biosensor for Escherichia coli Detection [J]. Analytical Letters, 2011, 44(16): 2559-2570.
[15] 吴会旺. 用于检测汞离子及腺苷的DNA生物传感器研究
[D]. 长沙: 湖南大学, 2009.
[16] Kong R M, Zhang X B, Zhang L L, et al. An ultrasensitive
electrochemical “turn-on” label-free biosensor for Hg2+ with AuNP-functionalized reportor DNA as a signal amplifier [J]. Chem Commun, 2009, 45(37): 5633-5635.
[17] 刘雪平. 基于纳米金信号转换和信号放大的新型生物传
感技术研究[D]. 长沙: 湖南大学, 2009.
[18] Huang D M, Liu H, Zhang B, et al. Highly sensitive
electrochemical detection of sequence-specific DNA of 35S promoter of cauliflower mosaic virusgene using CdSe quantum dots and gold nanoparticles[J]. Microchim Acta, 2009, 165: 243-248.
[19] 王学亮, 杨婕. DNA电化学生物传感器在转基因植物特
定序列基因检测中的应用[J]. 理化检测化学分册, 2011, 47(2): 133-138.
[20] Yang J, Yang T, Feng Y Y, et al. A DNA electrochemical
s e n s o r b a s e d o n n a n o g o l d-m o d i f i e d p o l y-2,6-pyridinedicarboxylic acid film and detection of PAT gene
fragment [J]. Anal Biochem, 2007, 365: 24-30.
120。