微生物代谢工程策略

简介
自从DNA重组技术的出现,基因工程的对象,尤其是微生物,已经成功从菌株的生产到重组蛋白和小分子化学物质。

对于后者,除了简单的基因工程策略，通常他们还需要通过多个细胞内合成反应,由各种因素更加复杂包括辅因子平衡和调节回路。

代谢细胞工程可以被定义为通过利用DNA重组和其他分子生物学技术有目的的修改细胞代谢。

代谢工程认为代谢和细胞系统作为一个整体, 从简单的基因工程考虑到整个生物过程的效率因此允许操作整个系统。

此外,代谢工程是有利在简单的基因工程或随机诱变,因为它允许定义工程细胞,从而避免不必要的细胞的变化，必要时,允许进一步的工程。

在最近的报告众多代谢工程的成功例子,L-valine[4],苏氨酸[5],番茄红素的高效生产。

抗疟药物前体[6],该类苄基异喹啉生物碱代表如何进行代谢工程，达到期望的目标。

像其他工业有用的化学物质,代谢工程的主要目标是药物。

植物次生代谢物的药用价值,如青蒿素酸,紫杉醇前体和苄基异喹啉生物碱已经成功的通过代谢产生。

微生物代谢工程产生的药物和药物前体
一种新型酰胺化多聚乙酰天蓝色链霉菌
克拉维酸棒状链霉菌
达托霉素变铅青链霉菌
达托霉素衍生物玫瑰孢链霉菌
红霉素A 红色糖多孢菌
磷霉素变铅青链霉菌
羊毛硫氨酸抗生素枯草菌素枯草杆菌
番茄红素大肠杆菌
青蒿素大肠杆菌
青蒿酸酿酒酵母
伊佛霉素链霉菌
棘霉素大肠杆菌
人甲状旁腺激素大肠杆菌
利用微生物工程通过重组大肠杆菌生产人胰岛素被认为是简单的DNA重组技术的结果,但有更大生产价值的复杂蛋白质也可以产生于微生物的代谢和细胞工程(11、12)。

用代谢工程开发结构和功能不同的抗生素代谢工程的应对出现的耐药病原体(13、14)。

在本文中, 描述有关代谢工程策略用于药品生产的例子。

另外,我们建议运用代谢工程发展新型药物和有效地生产。

工程微生物药物微生物药物的工厂
许多发现于微生物、植物和动物的化学物质和生物分子作为药物。

这些只有微量药物合成,它获得合适的数量是困难的。

这就是代谢工程发挥作用的地方。

我们理解代谢途径上的最新进展这些药物合成在一起，随着各种基因和分析工具的发展，使更系统和严格的微生物工程提高药品生产。

代谢工程微生物生产药物有几个优点：全合成或从自然资源中提取。

化学物质被用作药物通常具有复杂的结构，包括手性，用化学的方法合成是相当困难的。

同时,从自然资源提取有医学价值的化合物效率会很低,并且可能会导致负面的影响，减少环境资源和污染环境。

相反,药物可以在相对便宜的基板用微生物发酵产生，在一个受控的和一致的方式。

微生物菌体比高等生物另一个明显的优势是更快速的增长。

此外，微生物代谢工程可以比哺乳动物和植物细胞更容易执行,它允许修改产品的在结构上的代谢途径，生产结构更加多样化的具有有效的生物活性的类似物,如多酮类化合物非核糖体多肽。

这些优势是微生物生产药物和药物前体关键。

通过代谢工程生物合成药物和药物前体
虽然生产的药物的最终形式可能会有很多种,在很多情况下实验和经济条件下也支持生物合成药物前体。

如果有进行化学转化方法使微生物生产药物前体，得到其最终形式,药物前体的最终产品是有价值的。

在这些例子中，代谢工程用酿酒酵母生产青蒿素酸,它是一种抗疟药青蒿素前体,可以在人体里经过两个步骤以化学反应的方式转换最终具有活性的物质。

因此,用生物学方法高效的生产青蒿素前体是可能的。

在某些情况下,药物前体可能也有其他工业或药用价值,证明其生产规模大。

例如, L-valine （L·缬氨酸）是一种必需氨基酸,在食品行业具有重要的应用,包括日常食物添加剂和健康饮料、和动物饲料行业,也是一些抗生素的前体,莫能菌素, cervimycin C,valanimycin。

微生物代谢工程在药物前体的生物合成有较高影响是很好的说明，微生物系统最近的发展,允许生产各种苄基异喹啉生物碱。

苄基异喹啉是植物次生代谢产物，有广泛的医药应用,比如止痛剂化合物, 抗菌药物和抗疟和抗癌药物。

为此,(S)-reticuline（心果碱）,生物合成各种该类生物碱的关键中间体,微生物代谢工程和植物的基因第一次利用大肠杆菌生产。

在新建的途径中的大肠杆菌，单胺
氧化酶(MAO)将多巴胺转变成34-DHPAA和norcoclaurine。

目标药物主机选择增长的需求，遗传工具的可利用性，符合目的药物产品的生理适用性，生理适用性和代谢信息野生型菌株计算分析细胞的全基因组分析，预测工程目标,设计合理的实验分析数据组学数据中提取信息，系统与高通量组学数据分析代谢工程扩增反应，删除不必要的通路和结构，生物合成途径的不同的表达，优化使用的密码子，优化基因表达，组合生物合成工程应变发酵下游流程媒体设计，副产
品删除，发酵条件，喂养策略，净化复苏工业规模化生产
微生物代谢工程药物生产的一般策略。

要考虑的第一个问题是选择药物生产，然后,考虑各种因素包括药物的代谢特征和生产能力，选择合适的宿主菌株。

突变的可培养性，基因工具的可用性，计算仿真和高通量组学分析促进代谢和细胞网络的系统分析,预测转录产物水平下代谢表型,蛋白质、代谢物和在不同的条件下通量，在此情况下，执行实际工程。

通过建立新的路径执行代谢途径设计和优化，优化现有的途径,和监管回路工程。

使用发达的菌株,发酵和下游加工执行生产这种药物，从发酵性能，净化过程和复苏观察的基础上进一步代谢工程可以执行。

最终产物的在循环优化后用于工业生产药物。

合酶随后链接形成全去甲劳丹碱，然后，从日本黄连里提取的一系列酶被用于合成心果碱。

6OMT把全去甲劳丹碱转变成(S)-30-hydroxycoclaurine，CNMT把(S)-30-hydroxycoclaurine转变成(S)-30-hydroxy-N- methylcoclaurine ，最后40OMT 把(S)-30-hydroxy-N-methylcoclaurine转变成(S)-reticuline。

作为一个工作示例，由co-culturing工程大肠杆菌和美国酵母细胞使用(S)-reticuline作为药物前体，用两个苄基异喹啉生物碱，木兰花碱，(S)-scoulerine，合成用作抗菌剂的药剂。

这些工程大肠杆菌首先种植在中含有多巴胺以生产(S)-reticuline，然后美国酵母表达外源基因然后添加到相同的媒介来完成生产。

生产的不同的最终产品根据异源基因转化为酿酒酵母。

木兰花碱被生产用于当酿酒酵母被用于接种紫菫块茎碱合成酶基因和CNMT。

当BBE在酿酒酵母中表达时，(S)-scoulerine将代替它。

结果是，使用工程大肠杆菌合成相同的前体提供适当的外源基因利用代谢工程酿酒酵母生产各种各样的药品分子。

这是代谢工程做设计和生产药物前体的一个很好的例子，用其他方法很难做到。

代谢工程策略被用于生产苄基异喹啉生物碱，青蒿素酸，达托霉素类似物，紫色箭头表示不同基因的表达，蓝色箭头表示主机相应的反应，粗蓝色箭头表示放大反应，红色箭头表示调节基因，灰色物质代表运输物质穿过细胞膜。

(S)-reticuline 和two benzylisoquinoline alkaloids的生物合成途径，是由(S)-scoulerine和木兰花碱在大肠杆菌和酿酒酵母里协同培养。

青蒿酸的生物合成途径构造在酿酒酵母。

系统工程执行的每个在此文本里的反应步骤。

用FPP途径将可执行的经过筛选的工程大肠杆菌的可调基因间区域之间插入生物合成基因。

细胞产生青蒿素酸并运输到细胞外，依附到细胞表面。

达托霉素合成体的生物合成。

首先，128kb 达托霉素基因群表达在不同的宿主里，然后，进一步优化检测及达托霉素的净化。

放线菌紫素生物合成途径的失活，表明红X，培养基通过添加足够的磷酸盐进行优化。

达托霉素基因组的表达，通过组合式生物合成可以更加优化。

在红格子的氨基酸是那些受到定向诱变的替换基因表达来的。

通过这样来做，能够创造达托霉素的各种类似物。

其中，发现四个类似物表现出高效率，分别是3,4-DHPAA （3,4-dihydroxyphenylacetaldehyde）;
40OMT, （30-hydroxy-N-methylcoclaurine-40-O-methyltransferase）; 6OMT,
（norcoclaurine 6-O-methyltransferase）;ADS, （amorphadiene synthase）;
扩大微生物的作用
表1总结了最近的遗传和代谢工程学在药物和药物前体的成就。

此外，微生物代谢工程生产了不同的聚酮化合物，各方面有关人类健康的药剂，植物衍生品。

预示着在不久的将来，微生物，尤其是细菌可能代替植物和哺乳动物细胞。

例如，细菌是现在能够执行糖基化，它是一个重要的翻译后的修正，使蛋白质药物具有功能，甚至生产各种抗体。

微生物代谢工程可以有效地获得小分子药物和药物前体，被认为是更好的目标产品。

在表一，作为实例。

考虑到微生物代谢工程的快速发展,更高效的细菌或微生物生产系统将取代当前的生产系统对国家来说并不太难。

代谢工程的一般策略细菌
代谢工程策略用于生产本质上对药物生产有良好效果各种化学物质。

药品生产的遗传工具和寄宿株选择的基本标准本质上是相同。

代谢途径的优化和网络化也需要同样的要求在本节中,我们讨论的关键问题被认为是对微生物代谢工程药品生产的成功在于关注小分子药物。

寄助株
寄助株是一个生产药物的微型化工厂，而且也是最重要的考虑因素之一。

选择一个合适的宿主菌株需要考虑几个因素，最重要的标准之一是检查寄助株
完成代谢转换的能力，不同微生物显然拥有不同的代谢功能。

大肠杆菌是代谢工程最受欢迎的。

有时候也要考虑到其他微生物也可能对生产所需产品有更好的代谢能力。

例如，尽管大肠杆菌由于其快速的细胞生长和最好的基因工程工具的可用性，在药物生产中是一个很有优势的宿主，但是它缺乏合成聚酮化合物所必需的酶。

红霉糖多孢菌，天蓝色链霉菌，变铅青链霉菌等自然地成为了生产聚酮化合物类化学产品更好的微生物宿主。

同样的，即使工程大肠杆菌表现良好，我们也可以用棒状杆菌更好的生产赖氨酸等其他的氨基酸。

基因工程工具的实用性如表达载体，转换协议。

而染色体基因增减需要被考虑是代谢工程必不可少的工具它需要执行删除减少产品形成的内源和外源基因的过度表达。

自然的生产药品的微生物，特别是那些生产抗生素的微生物，可能没有特别的基因操作系统。

由于其增长缓慢，很难做到遗传工程期待的生长速度。

如果不是靠这些基因工具，你能想象培养他们有多难。

另一方面，如果有人能够挑选出另一种更好的微生物，虽不能大量生产所需的产品，但是有更好的基因操作系统可以利用。

培养细胞在不同尺度的可行性，包括烧瓶、小发酵罐、半规模发酵桶,和工业规模发酵罐，他们的评估取决于规模操作的需要。

大部分情况下，需要检查寄宿菌株生长在使用廉价的碳基板做的简单培养基的能力,因为它是极大地关联着生物工程成本竞争力，特别是对于那些批量的生产的化学物质。

此外，宿主微生物的遗传和生理学背景需要被彻底地检查，以便于选择能提供适当细胞内环境的宿主细胞。

生产足够多的前体细胞或者氧化还原物质，用于协调管理基因和成功地生物合成药
物。

如果并非如此，需要更密集的代谢工程一起调节基因，最后,当宿主的各个地方都被系统利用时，基因组的优点和代谢信息是有用的。

然而,应该指出的是,全基因组测序变得越来越容易和便宜时，因此确定一个宿主微生物的完整的基因组序列并不是一个艰巨的任务了。

基因操作
一旦一个宿主被决定，代谢工程策略将被开发。

在这过程中，通常需要一系列的基因操作,主要包括超表达和基因敲除和循环管理的操作。

超表达和基因敲除的基因表现是建立新的代谢途径，增快新陈代谢向产品发生，减少或关闭不好的的代谢流动，平衡调节使代谢向最优产品流动。

所有的都是为了最终产品的形成。

无论如何,有复杂的监管机制控制代谢流向再分配。

因此，通过将细胞和代谢网络这个细胞系统作为一个整体来分析。

这样的一个最近的例子是大肠杆菌生产L·缬氨酸的代谢工程。

首先,生物合成途径负责合成L·异亮氨酸，L·亮氨酸，和泛酸盐，通过定点诱变和染色体DNA替换形成反馈抑制和转录衰减控制影响L·缬氨酸生产，于在工程大肠杆菌菌株里L·缬氨酸形成同样的前体。

然后,最早的生物合成操纵子用L·缬氨酸途径扩充。

系统性通过分析和工程，这最初工程菌被进一步提高了，将在下面描述。

另一个很好的例子是微生物菌株的发展生产出了如前所诉的苄基异喹啉生物碱的不同产品。

除了系统性分析，代谢工程和监管网络，管理启动子，密码子，全部转录因子，基因间序列能够在表现水平的修改多个或者个别基因。

所有这些需要用一个连贯的和系统的方式执行，来开发优质生产的菌株。

正如最近在代谢工程成就观察到的那样。

高通量组学数据的使用
所谓的组学技术，既是大规模的全基因组分析,系统性分析使细胞，从几个不同的角度以整体的方式了解细胞生理学。

现在从组学分析中提取信息用作预测新的工程目标或很难直观地识别它们时重新设计深层发酵策略。

例如转录组数据在总体范围内的使用DNA微阵列揭示基因表达水平，帮助一个总体监管者识别大肠杆菌生产菌株生产. L·缬氨酸出口国扩大范围。

转录组数据在分析细胞和为药品生产重新设计实验有用。

例如，比较两种链霉菌属菌种的转录组性能分析。

一个生产更高产量的阿维菌素（一种抗寄生虫药）。

另一个生产出低产量阿维菌素，为了理解高产量阿维菌素的遗传机制。

这结果揭示了在高产菌中的几个超表达基因，能够被用作高产阿维菌素前体的逆向工程。

综上，蛋白质组和代谢组数据可以使用类似于鉴定新的工程目标。

因为这些高通量组学分析导致细胞的系统分析，他们预计将更频繁地用于药物生产识别和克服我们的生物知识和理解
的局限性。

代谢工程目标的计算机预测
虽然没有经常练习,计算建模和仿真是药物生产微生物代谢工程的重要工具，帮助描述和建立细胞工程的系统性。

整个生物过程的考虑
代谢工程是最重要的目标之一是有效的生产所需的产品，考虑整个生物过程是在早期阶段的代谢工程是至关重要的，因为微生物代谢工程在试管或培养烧瓶过程中是一个常规操作。

用这种方法开发的优良菌株并不一定在实际生产的大型发酵罐表现优异。

此外，在复苏和净化过程一个可能会遇到副产品中污染。

一个明显的代谢工程战略是在细胞的一些表达的移除，以使其不形成不必要的副产品，极大提促进产品净化。

微生物代谢工程的例子，如。

人造乳酸，醋酸纤维素及其制成的产品，乙醇。

微生物发酵的培养基应该小心设计，他的组件会直接影响恢复，净化过程，和随后整个生物过程的成本。

例如，根据产品而定，能用一个化学确定成分培养基或者一个廉价合成的培养基。

用于生产高价格药物分子，培养基成本并不是问题。

应该注意的是,应该在营养缺陷型或工程突变体添加几种营养成分，这些菌种没有补充他们会不能增长或显示不令人满意地生长阻滞。

此外，如果产品是有毒的，细胞需要被做出一些处理来使他们本身能够增加对有毒物质的耐受性。

转录因子工程就是这样一个很好的例子。

前景
源于高通量组学和大规模基因组计算分析，代谢工程使得复杂各种微生物工程高效生产各种代谢物。

未来会如何？代谢工程在参与开发新的药物和药物前体将越来越重要，包括生物体中发现有复杂结构的次生代谢物，对合成化学来说很困难的手性研究。

它还将允许创建化合物数据库，用于对新药进行筛选。

一旦发现一种新药，它可以用理性的随机方法以系统代谢工程策略提高生产率。

高通量组学技术和规模化基因组技术在计算机模拟公司将会更积极地用来从不同的角度评估的特定的新陈代谢，管理，信息网络，这将使系统预测目标基因，运作路线和信息网络是怎样运作的。

我们有能力进一步用用一种综合的方式分析这些异构数据,将可能研发出更加强劲的代谢工程策略。

新的基因工具，如可调控基因的运用，生物过程实际操作中终产物变量的最佳化，将会为改善生产力做出进一步的贡献。

代谢工程用于药品生产的几个成功的例子已经开始成功，这种趋势将会加速继续。

值得期待的是，在不久的将来微生物代谢工程将成为开发和生产的药物的一个重要平台。

应用
微生物生产青蒿素酸，
开发了达托霉素类似物前体。