用免疫胶体金层析法检测血液标本中2型单纯疱疹病毒抗体

用免疫胶体金层析法检测血液标本中2型单纯疱疹病毒抗体

发表时间：2012-08-09T17:17:52.390Z 来源：《中外健康文摘》2012年第18期供稿作者：王丹丹崔连东[导读] 近年来，通过对重组的HSV-2 糖蛋白研究，已经有检测该病毒特异性抗体的商品化的试剂盒供临床实验室应用。

王丹丹崔连东（辽宁省人民医院检验科辽宁沈阳110015）【中图分类号】R446.11【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）18-0057-02 【摘要】目的建立了一种特异性的用于免疫胶体金层析技术（GICA）检测单纯疱疹病毒2型（HSV-2）的免疫球蛋白IgG。方法共有239份血清和100份全血标本用免疫胶体金层析法进行检测，同时，血清的标本用ELISA方法作对照检测，全血标本分别用ELISA 和免疫印迹法（IB）确定。结果与ELISA 方法对比，GICA测定特异性的HSV-2抗体的敏感性为 100%（69/69，特异性为97.1%（171/176）；与HSV-1.轮状病毒和EB病毒抗体的交叉反应分别为2.7%（3/112），2.9%（1/34）和6.2%（1/16）；与带状疱疹病毒和人类巨细胞病毒无交叉反应；一定量胆红素、甘油三酯或血红蛋白对该试验无影响；不同的采血方法如毛细管法，EDTA或肝素抗凝的静脉采血法，及血清对实验结果无影响。结论用免疫胶体金层析技术（GICA）检测单纯疱疹病毒2型（HSV-2）的免疫球蛋白IgG是一种方便、简捷、快速和准确的试验方法。

【关键词】免疫胶体金层析法单纯疱疹病毒ELISA 免疫印迹单纯疱疹病毒（HSV）是一种常见的可引起人类多种疾病的世界范围内的病毒。HSV可分为两种类型：HSV-1和HSV-2。HSV-1通常感染人的舌、口、唇、筛窦和眼，而HSV-2 却与人类的生殖道和新生儿的感染相关。HSV可感染不同年龄的人群如新生儿、儿童和成年人。据统计，40岁的人群中，超过90%人血液中HSV-1 抗体呈阳性[1]。在美国，大多数的性生活活跃的年轻人均有生殖道疱疹病毒感染[2]。 HSV-2 的主要传播方式是通过性传播[3]。典型的症状为疱疹性生殖道炎症，其表现为生殖道局部的溃烂，同时可伴随发热、淋巴结炎和尿失禁。有些研究表明85%的原发疱疹性生殖道炎症是由HSV-2引起的[4]。由于很多的病例无明显的临床症状，因此，要有效地管理疱疹病毒的感染者，用血清学诊断来区分两种类型的病毒就显得尤为重要[5]。这两种类型的病毒的抗原有极高的相似性，然而，它们各自的糖蛋白却有很大的差异，可刺激机体产生不同的特异性抗体，并可用于商业上的诊断产品[6,7]。与蛋白印迹的方法相比，型特异性的血清学诊断方法也可以准确地诊断HSV-1和HSV-2的感染[8]。在临床实验诊断中，HSV-2的特异性血清诊断学方法主要是免疫印迹和酶联免疫吸附试验（ELISA）。这里我们介绍一种简便、快速，灵敏度高和特异性强的免疫胶体金层析技术，用于HSV-2的特异性糖蛋白抗体的检测。

1 材料和方法

1.1标本359例临床收集用于检测HSV-1.2抗体的患者血清，其参考的结果是通过ELSIA方法获得。同时，为了研究交叉试验，271份血清检测检测了巨细胞病毒(n=11)、带状疱疹病毒(n = 14)、EB病毒(n = 16),和轮状病毒(n=34)；为了研究干扰试验，在两个HSV-2抗体阳性和阴性的标本中加入甘油三酯、白蛋白、胆红素和血红蛋白，其血清终浓度分别为10mg/ml,60mg/ml、0.2mg/ml和l220mg/ml。为了研究不同的采血方法对胶体金层析法试验结果的影响，100名志愿者，分别用指尖毛细管采血法，EDTA及肝素抗凝静脉采血法和单纯血清采血法采血。试验采用双盲法，作为参考方法，HSV-2抗体检测采用商品ELISA试剂盒检测患者的血清标本。

1.2免疫胶体金层析法当标本中存在HSV抗体时，抗体先与 40nm 的胶体金结合鼠抗人IgG抗体结合，随着硝酸纤维素膜的层析作用，结合物向前移动。就可以与三个条带上分别标记了HSV-1糖蛋白抗原、HSV-1糖蛋白抗原和羊抗鼠抗体结合，相应的条带就会出现。当测试条带和控制条带均出现时，为阳性；当测试条带未出现而控制条带出现为阴性；仅有测试条带出现或未出现而控制条带未出现，表明检测结果无效。所有检测结果均要求第二个试验人员确认。其示意图如图1

图1 免疫层析法检测卡示意图

1.3 参考方法用市售的 ELISA和免疫印迹试剂盒方法作对照，操作方法严格按照说明书的要求。用相应的检测巨细胞病毒、带状疱疹病毒、EB病毒和轮状病毒的ELISA试剂盒对标本进行检测。

1.4 数据评价接受者操作特性曲线（ROC）、似然比、阳性阴性预测值（PPV、NPV）等用MedCalc V9.3.0.0 统计软件统计。

2 结果

2.1用GICA方法检测血清的结果

在总共359份血清标本中，用GICA法和ELISA法分别检测，有89例HSV-2抗体阳性，阳性率为25.2%（89/359）。两种方法均阳性的为89例; 均阴性为257例; 有6份标本ELISA检测结果在临界值的范围内。其结果见表1 。表1 CIGA与ELISA 法检测HSV-2抗体结果

a 数据为采用CIGA方法和ELISA 方法分别检测359份病人标本和100例健康献血者的标本结果

b 指数≥1.1；c指数0.9-1.09 (该数据没有统计)；d指数小于0.9

确定GICA 实验的灵敏度和特异性的受试者工作特征曲线（ROC）见图2.ROC表明，以ELISA法为参考方法,该方法的灵敏度为100%，特异性为98.1%。曲线下的面积（AUC）为0.999。阳性预测值为93.7%，阴性预测值为100%

100% 特异性图

图2 GICA 实验受试者工作特征曲线（ROC）

2.2 GICA检测全血的结果为了评价该方法在不同采血方法中的表现，对一些患者3分别用血清、EDTA 抗凝血、肝素抗凝血和指尖等采血方法。用GICA对这些标本进行检测，以血清检测HSV-抗体的ELISA方法和免疫印迹方法为对照。均为阳性的为13例，均为阴性的是

76例。其特异性和敏感性分别为100%和81.2%。结果见表1

2.3 交叉实验结果对HSV-2抗体阴性的170份血清标本，分别用ELISA 方法检测巨细胞病毒、带状疱疹病毒、EB病毒和轮状病毒的抗体。然后用GICA法对这些标本进行检测，结果仅有2.4%（4/170）为阳性，结果见表2

表2 GICA与ELISA和免疫印迹检测交叉实验结果

2.4 干扰实验结果为了研究某些情况下对GICA方法的影响，在两个HSV-2 抗体阳性和阴性的标本中加入甘油三酯、白蛋白、胆红素和血红蛋白，其血清终浓度分别为10mg/ml、 60mg/ml、0.2mg/ml和l220mg/ml。其结果显示没有干扰。

3 讨论

许多泌尿生殖道感染的病例，患者没有明显的症状。确定感染疱疹病毒的类型在诊断、治疗和预防中起到重要的作用[9]。而且，HSV-2感染往往与HIV的感染相关联[10]。近年来，通过对重组的HSV-2 糖蛋白研究，已经有检测该病毒特异性抗体的商品化的试剂盒供临床实验室应用。然而，大多数的检测方法耗时，而且需要特殊的设备和技术人员，特别是对于偏远和经济欠发达的地区，不能提供及时准确地的检测结果，以至于延误患者的诊断和治疗。我们研发的这种快速的免疫层析胶体金法，可以弥补这些不足。

实验表明，用免疫胶体金层析法可以快速检测HSV-2的特异性抗体。不同的血液标本，如血清、肝素和EDTA抗凝血、以及指尖血对实验结果均没有影响。作为检测HSV-2抗体的标准方法之一，研究表明ELISA对无症状的患者有较好的应用价值[11]。胶体金免疫层析法与ELISA 实验的检测结果对比,也有很高的一致性。而且，胶体金免疫层析法可直接用未稀释的血清标本进行检测，而ELISA法通常要进行1：100倍的稀释后血清。因此，胶体金免疫层析法可能会有较高的灵敏度，特别是对于HSV-2 抗体滴度低和抗体的亲和力弱的血清标本。但这种现象，在检测全血标本和指尖采血标本的检测中，表现不明显。通过与检测HSV抗体的标准参考方法如ELISA和免疫印迹法的对比，胶体金免疫层析法有很好的特异性和灵敏度。而且不受血清中的甘油三酯、血红蛋白、白蛋白和胆红素等因素的干扰。

参考文献

[1]Aurelian,L.1992.Herpes simplex viruses,p.473-497.In S.Specter and ncz (ed.),Clinical virologymAnual,2nd ed.Elsevier,New York,NY.

[2]Centers for Disease Control and Prevention.2002.Sexually transmitted diseases treatment guidelines.Morb.Mortal.Wkly.Rep.51:1-80.

[3]Schacker,T,J.Zeh,H.Hu,M.Shaughnessy,and L.Corey.2002.Changes in plasma human immunodeficiency virus type 1 RNA associated with herpes simplex virus reactivation and suppression.J.Infect.Dis.186:1718-1725.

[4]Arvin,A,and C.Prober.1995.Herpes simplex viruses,p.876-883.In P.R.Murray,E.J.Baron,M.A.Pfaller,F.Tenover,and R.H.Yolken