第八讲 生殖毒性研究-PDF

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Ⅰ段：生育力和早期胚胎发育毒性试验 （一般生殖毒性试验）
目的：评价受试物对配子成熟、交配行为、生育力、胚 胎着床的影响（前述生殖周期的A和B阶段）。 给药期：雄性从交配前4周开始染毒，并持续至交配 成功；雌性交配前2周开始染毒（以覆盖3～4个动情 周期），至妊娠第6天受精卵着床。
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Ⅱ段：肧体-胎体毒性试验（致畸试验）
Ø 生殖发育过程较机体其他系统更为敏感； Ø 外源化学物对生殖发育过程影响的范围较为广
泛和深远。不仅直接涉及雌雄两性个体，同时 还对其第二代甚至以后世代的个体产生影响。
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第二节 生殖毒性及其评定
Ø 生殖毒理学历史 Ø 生殖毒性 Ø 生殖毒性的评价方法
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生殖毒理学历史
Ø 1950年美国霍普金斯大学医院发现，怀孕期间
第八讲 生殖发育毒性及其 试验与评价方法
第一一节 概 述
Ø 哺乳动物的生育繁殖过程 Ø 外源化学物对生殖发育的影响 Ø 外源化学物对生殖发育的影响以及损害作
用的特点
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哺乳动物的生育繁殖过程
生殖发育是哺乳动物繁衍种族的生理过程， 其中包含生殖细胞发生，即精子发生和卵细胞 发生、配子的释放、性周期和性行为、卵细胞 受精、受精卵的卵裂、胚泡的形成、植入或着 床、胚胎形成、胚胎发育、器官发生（或称器 官形成）、胎仔发育、分娩和哺乳过程。 生殖发育也可称繁殖过程。
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现代实验畸胎学
现代实验畸胎学始于19世纪初，当时的胚胎学家使用各 种物理因素（震动、倒置、针刺）和化学毒物处理鸡蛋， 产生了畸形小鸡，有神经管缺陷、无脑、脊柱裂、独眼、 心脏缺陷、位置颠倒和联体双胞胎等。他们还注意到作用 时间在决定畸形类型方面比损伤的性质更为重要。
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20世纪早期
发现多种环境因素（温度、微生物毒素、药物）可以干 扰鸟、爬虫类、鱼和两栖类的发育。 1935年，Hale首次报道维生素A缺乏诱导母 猪产下突眼和腭裂的畸形后代。
或胎儿正常发育过程造成干扰，使子代出生后具有畸形的 化合物。
v 畸胎:具有畸形的胚胎或胎仔。 v 致畸试验:评定外源化学物是否具有致畸作用的试验。
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3. 胚胎毒性作用 外源化学物引起的胎仔生长发育迟缓和功能缺 陷不全的损害作用，对母体无显著的毒效应。 4. 母体毒性作用 母体毒性作用是指外源化学物在一定剂量下， 对受孕母体产生的损害作用。具体表现包括体重 减轻、出现某些临床症伏、直至死亡。
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2. 雌性生殖毒性评价
Ø 三代两窝
F０ （断奶或出生８周）
第一次交配 第二次交配 给予受试物８到１２周
F１a
观察三个月，喂饲普通饲料 ，观察其生长发育情况
F１b
21天断乳后给予 受试物８到１２周
F２a
观察三个月，喂饲普通饲料 ，观察其生长发育情况
F２b
21天断乳后给予受 试物８到１２周
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Ø 母体毒性作用与致畸作用关系
v 具有致畸作用，但无母体毒性出现。 v 出现致畸作用的同时也表现母体毒性。 v 仅具有母体毒性，但不具有致畸作用。 v 在一一定剂量下，既不呈现母体毒性，也未见致畸作用。v 不具有特定致畸作来自机理，但可破坏母体正常生理稳态。
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5. 畸形与变异
v 在胚胎或胎儿出现器官形态结构异常称为畸形。 v 机体的形态结构或生理功能，在同一一物种的子代
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重大历史事件
反应停 thalidomide
发育毒理学 developmental toxicology
是研究发育中的生物体从受精卵、妊娠 以及出生后直到性成熟期间，由于暴露于 外源性理化因素而产生的各种发育异常及 其机制，为理化因素的危险度或安全性评 价和预防措施提供依据的一门学科。
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基本概念
F３a
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F３b
Ø 两代一一窝(和一一代一一窝)生殖试验
出生第８周给予受试物（F０） 第１６-１９周 雌雄交配 F１（每窝选留幼仔８只，雌雄各半） 断奶，给予受试物 F１交配 F２出生，每窝留８只幼仔 F２断奶，检查发育情况
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观察指标：
Ö 受孕率: 反映雌性动物生育能力以及雌性动物受孕情况
害作用的试验。
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三段生殖毒性试验
主要是根据发育阶段的区别来设计的，每一段试 验大致相当于上述两个阶段。
Ⅰ段：生育力和早期胚胎发育毒性试验 （一般生殖毒性试验，主要反映妊娠前及妊 娠初期的情况） Ⅱ段：肧体-胎体毒性试验（致畸试验） Ⅲ段：出生前后发育毒性试验 （围生期毒性试验，反映外源化合物对胚胎 发育后期、母代分娩过程、哺乳期的影响。）
1.发育毒性(developmental toxicity)
指出生前经父体和(或)母体接触外源性理化因素引起的在 子代到达成体之前出现的有害作用，也称为胚胎毒性。具体表 现可分为:
v 生长迟缓: 即胚胎与胎仔的发育过程在外源化学物影响下，
较正常的发育过程缓慢。
v 畸形: 由于外源化学物干扰，活产胎仔胎儿出生时，某种器
目的：评价自胚泡着床到硬腭闭合阶段暴露受试物 对妊娠母体和胚胎与胎仔发育的有害效应。包括母 体毒性、胚胎或胎儿死亡、生长改变和结构异常。 给药期：为着床期到硬腭闭合，即器官形成期；大 、小鼠为受孕第6～15天，家兔为第6～18天。
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Ⅲ段：出生前后发育毒性试验 （围生期毒性试验）
目的：评价母体从着床至断乳期间接触受试物对妊娠 /哺乳母体和对胎仔及仔代直至性成熟的有害效应。 给药期：着床期开始，至仔鼠断乳。大鼠孕15天至产 后28天。
服用黄体酮，先后有600多名女婴出现生殖器 男性化畸形 。
Ø 1956年用于治疗妊娠反应的反应停，1961年后
出现近万例短肢畸形儿(海豹畸形)。
Ø 二恶英(TCDD)造成的大面积污染及其与人群生
殖危害的关系至今仍不清楚 。
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Ø
过去半个世纪震惊全球的系列中毒或灾难
事件的发生，在世界范围内提高了人们对用药 的安全意识，高度关注新的化学物对生殖内分 泌系统或妊娠结局的不良影响，促进了与生殖 内分泌系统安全相关法律的产生和研究方法指 南的问世。
能力
幼子哺乳成活率＝21天断乳幼子存活数／出生后4天 幼子存活数×100％ Ö 除 上述４个指标外，还应该注意出生幼仔是否有畸 形存，对死亡的幼仔应进行畸形检查，可为下一一步致 畸试验提供参考
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二 致畸胎试验
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生殖是对亲代动物而言，从配子生成、受精到胎 体分娩是一生殖过程。 发育主要是对子代而言，从受精卵到性成熟的青 春期甚至一直到衰老都属于发育过程。发育毒性也 称为胚胎毒性。
官表现形态结构异常。
v 功能不全: 即胎仔的生化、生理、代谢、免疫、神经活动及
行为的缺陷或异常。
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胚胎死亡: 某些外源化学物在一定剂量范围内，可在胚胎 或胎仔发育期间对胚胎或胎仔具有损害作用，并使其死亡。
2. 畸形、畸胎和致畸物
v 畸形:器官形态的异常。 v 致畸物或致畸原:凡在一定剂量下，能通过母体对胚胎
与亲代之间或子代的个体之间，有时出现不完全 相同的现象，即为变异。
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致畸作用的毒理学特点
Ø 器官发生期的胚胎对致畸物最为敏感 Ø 剂量与效应关系较为复杂 v 剂量效应关系复杂的表现及原因
在一一定范围内，畸胎率与剂量成正比，当高到一一定水平引 起胚胎死亡而掩盖了致畸作用，畸胎率反而会下降。
v 致畸作用的剂量效应曲线较为陡峭，斜率很大。
受孕率＝妊娠雌性动物数／交配雌性动物数×100％
Ö 正常分娩率: 反映雌性动物妊娠过程是否受到影响
幼子出生存活率＝正常分娩雌性动物数／妊娠动物数 ×100％
Ö 幼仔出生存活率: 反映雌性动物分娩过程是否正常
幼子出生存活率＝出生后4天存活幼子数／分娩时出生幼子 数×100％
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Ö 幼 仔哺育成活率 : 反映雌性动物授乳哺育幼仔的
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外源化学物对生殖发育的影响
Ø 干扰生殖发育的任何环节，并造成损害作用。 Ø 可以通过对内分泌系统，特别是对性腺的作用，
发生间接的影响。
Ø 神经系统对内分泌功能也有调节作用，通过下
丘脑-垂体-睾丸轴(下丘脑-垂体-卵巢轴)两条 途径作用于生殖发育过程 。
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外源化学物对生殖发育损害作 用的特点
• 中剂量组应仅能出现极为轻微的中毒症状。 • 如果1000mg/kg体重剂量对生育力无损害作用，或最高剂
量可引起亲代动物表现一一般毒性作用，但对生育力无不利 影响，则可不进行其他剂量实验。
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v 染 毒途径 : 动物接触受试物的方法应参照人类实
际接触途径
交配前雄性动物应染毒4〜～10周，雌性动物2周 一一般可混入饲料或饮水中，也可采用灌胃或胶囊法。
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生殖毒性表现
外源化学物对生殖的过程的损害作用可以 表现为性淡漠，性无能或各种形式的性功能减 退。雌性可出现排卵规律改变，月经失调或失 经，卵巢萎缩，受孕减少，胚胎死亡，生殖能 力的降低不孕或不育等。雄性可表现为睾丸萎 缩或坏死，精子数目减少。
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对雄性生殖系统的毒作用
直接损伤睾丸中的细胞群
对睾丸的毒性
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连续、完整的生殖发育过程的六个阶段
A.从交配前到受孕：检查成年雄性和雌性生殖功能、配子 的发育与成熟、交配行为、受精。 B.从受孕到着床：检查成年雌性生殖功能、胚胎着床前 发育、着床。 C.从着床到硬腭闭合：检查成年雌性生殖功能、肧体发育 、主要器官形成。 D.从硬腭闭合到妊娠结束：检查成年雌性生殖功能、胎体 的发育与生长、器官的发育与生长。 E.从出生到断乳：检查成年雌性生殖功能、新生仔对宫外 生活的适应性、断乳前的发育与生长。 F.从断乳到性成熟：检查断乳后的发育与生长、对独立生 活的适应、达到完全的性功能。
v 动 物 : 至少采用一一种动物，推荐用大鼠；每组雌
雄各20只；雌性动物妊娠13～15天处死，雄性交 配成功处死。
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评价方法
1. 雄性生殖毒性评价 动物试验 l 精子生成分析（精子计数、形态学及其活率） l 精子功能检测 l 睾丸标志酶活性检测 l 交配实验 l 显性致死试验
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畸胎学（古代）
现代实验畸胎学（19世纪）
发育毒理学
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畸胎学 （古代）
畸胎学是发育毒理学的基础。 畸胎学作为一门描述性科学在文字之前就已经存在了， 四大文明古国都有畸胎的记载。最早可以追溯到公元 前6500年土耳其的联体婴儿石刻。5000年前埃及壁画所 描述的唇腭裂和软骨发育不全等。 当时人们相信出生异常的婴儿是上天的惩罚、星象的反 应和未来的预兆，有的则以为是人和动物之间杂交的 结果。William Harvey于1651年提出了发育受阻学说， 认为畸形起因于器官或结构的不完全发育。
对精子发生 的有害作用
继发性的影响精子发生 改变下丘脑-垂体功能 直接影响睾丸细胞功能
精子生成障碍 性欲异常，丧失生育能力 引起生殖细胞突变，造成可遗传损害
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对雌性生殖系统的毒作用
卵母细胞数下降/突变
对卵巢的损害
生长卵泡和成熟卵泡降低，排 卵抑制，受孕力下降 干扰卵巢内分泌，影响受精 /着床/胚胎发育
生殖道的损害：影响运送卵子/受精/受精卵发育 对下丘脑-垂体系统的损害：闭经，受孕力降低。
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生殖毒性的评价
Ø 评定的主要依据是交配后母体受孕情况（受孕
率）、妊娠过程情况（正常妊娠率）、子代动 物分娩出生情况（出生存活率）、授乳哺育 （哺育成活率）以及断奶后发育情况等。
Ø 是检查外源化学物对动物生育繁殖机能有无损
致畸带：从无作用剂量到胚胎死亡剂量的范围
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致畸作用的毒理学特点
Ø 种属差异以及个体差异在致畸作用中较为明显 v 在不同动物并不一一定都具有致畸作用，引起畸
形的类型也不一一致。
v 种间差异即同一一物种中不同品系之间存在的差
异，在致畸作用中也极明显。
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致畸作用机理
Wilsom(1977)提出了畸形发生的9种机制，包 括突变、染色体断裂、有丝分裂改变、改变核 酸完整性或功能、减少前体或底物的补给、减 少能源支持、改变膜特性、渗透压不平衡和酶 抑制作用。近年来在分子水平的研究有很大的 进展，虽然胚胎有代偿机制弥补外源性化学物 的影响，但是，是否产生畸形依赖于在致病过 程中的每个步骤在损伤和修复之间的平衡。
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一一、 一一般生殖毒性试验方法原则
v 受试动物：多用性成熟大鼠，也可用小鼠或家兔 v 剂量分组：一一般设立三个剂量组和两个对照组
• 高剂量组产生轻微毒性症状，但其死亡率不大于10%，也
不能完全丧失生育能力。相当于1/10LD50。
• 低剂量组则不应产生任何可观察到的损害效应。相当于高
剂量组的1/30。