石蜡油-EMS花粉诱变技术

EMS(EthylMethaneSulfonate,甲基磺酸乙酯)是一种烷化剂,其诱变机理是通过与核苷酸中的嘌呤、嘧啶分子直接反应来诱发突变。EMS诱发的突变体主要通过两个步骤完成:首先鸟嘌呤的O6位置被烷基化,而后在DNA复制过程中,烷基化的鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对,导致碱基交换,即G∶C变为A∶T,形成点突变。

早在60年代,人们就已开始采用EMS水溶液处理植物种子,但诱变效率很低。自Neuffer 等(1978)将EMS溶于石蜡油中处理玉米花粉获得成功后,石蜡油_EMS处理花粉诱变技术在国外广泛应用起来。Greaves等(1986)采用含0.667×10-3EMS的石蜡油处理玉米自交系的成熟花粉40min,在M2代施以除草剂的筛选环境,获得抗除草剂Pursuit突变体,该突变体含抗除草剂显性基因。1987年美国ICI种子公司用EMS处理花粉获得糯质、甜质玉米突变体。张铭堂(1989)采用该技术获得诱变率为0·2%的糯质基因。据报道,AllenWright等在M3后代中筛选出10个高赖氨酸突变材料。中国农业大学等单位开展了特用玉米突变体的筛选研究。石蜡油_EMS花粉诱变技术,由于诱变剂直接作用于配子,具有诱变率高,诱变范围广,且产生的突变体多为点突变的特点,较传统电离辐射优越。研究表明,石蜡油_EMS处理花粉,平均每个位点上单个基因的隐性和显性突变率可达千分之一和万分之一以上,可以在较大的诱变后代群体中筛选出目标突变体。该技术将是改良自交系和进行种质创新的有效工具。

诱变剂：EMS(甲基磺酸乙酯)，德国产。

载体剂：液体石蜡天津产。

诱变处理：参照Neuffer的花粉诱变方法，具体见参考文献31。

(4)诱变材料种植:为了处理方便和工作人员安全,该处理自交系(Mo)行距加宽到75cm,株距按常规种植;

(5)Mo预处理:提前根除杂株;在诱变的前一天下午,雌穗剪苞叶,雄穗去掉老花药后分别套袋。

(6)处理液制备:参照Neuffer的方法。在通风橱内,按照1mLEMS:100mL液体石蜡的比例配制母液,在磁力搅拌器上搅拌1h混合均匀;在大田处理前,配成所需浓度。本试验采用了大多数人认同的浓度0.667×10-3和比它低的1×10-4以及比它高的1×10-3,1.5×10-3,2×10-3共5个浓度;C对照,为纯石蜡油处理。

(7)田间诱变处理:在适当的时间,收集新鲜花粉,过筛除去花药后,按照1体积花粉:10体积处理液的比例于棕色瓶里,在混匀器上间断的混匀,处理45min后,在田间用毛笔把相应的花粉授在相应的花丝上。

(8)后代处理:M0果穗成熟后收获,得到M1种子。M1种子全部按穗行单粒点播,苗期和成株期进行田间观察,并挂牌标记;将全部植株自交后得到M2代种子,并观察子粒突变。

M2代种子按穗行种植,每穗种3行,共60粒,每15行种植CK2行;抽雄时调查抽雄情况及株型和抗性等变异,并进行挂牌标记。将标有变异的植株自交得M3代种子;

M3自交种子种成穗行,每5行加一个对照;此代中,观察、记录各穗行的抽雄期及其他性状,将不同穗行同对照比较,选择整齐一致并与CK有明显差异的穗行即为突变纯合体,将有利用价值的突变体自交留种。

(9)生育期突变选择标准:每穗行的抽雄高峰期与CK的抽雄高峰期相差6天以上。

诱变处理先将EMS配成1%母液,保存

备用。参照Neuffer的诱变方法进行诱变。上午9~10时,收集玉米新鲜花粉,去掉花药,加入处理液中,并用医用混匀器间断振荡45min后,再用毛笔把处理的花粉授在相应的花丝上;本试验采用0、0·50、0·67、1·00、1·50和2·00mL/L共6个处理浓度。0为CK,用纯液体石蜡油处理。

诱变后代的处理后代M1、M2采用系普法、单粒点播,各代标记并全部自交保种;将M3

籽粒种成穗行鉴定。

试验方法

1配制母液

参照Neuffer方法。在通风炉内,按照1mlEMS∶100ml的石蜡油配制母液,在振荡搅拌器上搅拌1h以上,在处理花粉的当日清晨将母液用石蜡油稀释所需的浓度。

本试验采用普遍公认的处理浓度0.0667%。

2田间诱变处理

在处理的前一天选择新鲜的花丝刚抽出10cm左右的套袋果穗,剪短花丝至2cm左右,同时将雄穗套上,每个自交系处理100个果穗。在第二天上午采集新鲜花粉,与10倍花粉体积的石蜡油诱变剂混合,处理45min后用毛刷将花粉涂抹到花丝上,立即套上双层纸袋,扎住纸袋口,写好标签。果穗成熟后收获诱变果穗,得到M1代种子。收获诱变果穗, 统计每穗结实数, 并以用石蜡油处理的人工授粉果穗为对照, 计算处理当代果穗相对结实率。

3M1种子

按穗行法单粒点播,苗期至成熟期进行田间观察,并挂牌标记。将雄性不育株姊妹交,其余植株自交后得到M2代种子,并观察籽粒性状的突变。

4M2代种子

采用穗行法,按穗行种植,每穗种3行,每隔10个穗行种植对照3行;苗期和成熟期进行田间观察,抽雄时调查抽雄情况、株型和抗性等变异,并挂牌标记,将有变异的植株自交得M3代种子。5M3代种子

按穗行种植,每5行加一个对照;观察穗行变异性状并于对照比较,选择整齐一致并与对照有明显差异的穗行,将有利用价值的突变体自交留种。

6生育期突变体选择标准

每穗行的抽雄高峰期与对照的抽雄高峰期相差5d以上为早熟或晚熟。从第一个植株抽雄开始每天调查,选出早熟变异株,计算每天抽雄百分比,抽雄持续时间。

7叶型的变异标准

穗位叶长,以对照为标准,比对照长15cm以上为长叶变异,比对照短15cm以下为短叶变异;穗位叶宽,比对照宽3.5cm以上为宽叶变异,比对照窄3.5cm以上为窄叶变异。