酶学分析技术

4.计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最 大反应速度的比率
根据米-曼氏方程可以计算
5.设计适宜的底物浓度
酶促反应进程曲线表明，只有初速度才能真正代表酶 活性，一般要求初速度达到最大速度的90%～95%、底物 消耗率为1%～5%。这样既可以近似地表示酶活性，又不 致于使底物浓度过高而造成浪费。
(三)Vmax的应用
注意：固定时间法时间段的预定不宜太长，一般以30～60分 钟为宜。
（二）连续监测法
定义：测定底物或产物随时间的变化量，又称为速率法。
原理：
该方法每隔一定时间（10s～60s）测定一次底物或产 物的变化量，连续测定多点，然后将测定结果对时间作图 ，绘制反应速度曲线。
（二）Km值的应用
1.鉴定酶的种类
Km值是酶的特征常数，在反应条件一定时，只与 酶的种类和底物的性质有关，与酶的浓度无关。不同种 类的酶其Km值不同，对于一种未知的酶，可在规定的 条件下测定其Km值加以鉴定。
表7-1 某些酶的Km值
酶
底物
Km(mmol/L)
乳酸脱氢酶 己糖激酶
-半乳糖苷酶 碳酸酐酶 过氧化氢酶 蔗糖酶 糜蛋白酶
酶学分析技术
内容
第一节 酶活性测定的基本知识 第二节 酶活性测定方法及酶学分析的类型 第三节 同工酶测定 第四节 酶学分析在临床诊断上的应用 第五节 酶活性测定最适条件的选择
本章教学要求：
1、掌握酶活性的国际单位定义，酶活性浓度的表示方法及酶活性单位 的计算公式；酶活性测定的连续监测法和定时法的概念、区别和结果 的计算方法；酶偶联反应的在酶活性测定和酶法分析代谢物中的应用； 以NAD（P）H为指示系统和色素原底物在酶活性测定中的应用.
2、熟悉酶促反应进程；酶促反应底物动力学；酶学分析在临床诊断上 的应用。
3、了解Km值、Vmax值的应用及Km和Vmax的测定；同工酶测定和酶活性 测定最适条件的选择。
第一节 酶活性测定的基本知识
酶活性的概念 酶活性单位 酶活性单位的计算 酶促反应进程 酶促反应底物动力学
一、酶活性的概念
酶活性测定时首先要确定线性期，在此期测定反应速度才能准确代表酶活性。
酶促反应初速度
酶活性
酶的含量
五、酶促反应底物动力学
中间产物学说：
酶促反应进行时，酶首先与底物结合为中间产物，然后再催 化底物反应生成产物。E + S ES → E + P
米-曼氏方程：
Vmax〔S〕 v = —————
〔S〕+ Km
明确测定方法的酶单位定义，按照酶单位 定义确定物质量、体积和时间的单位，
运用公式进行计算。
计算公式:
产物的增加量 每单位规定的保温时间 1000（ml） 酶单位/升 = —————————×——————————×————————
每单位规定的产物增加量 实际保温时间 实际标本用量（ml）
分光光度法测定的公式：
（A测定 – A对照）·V总·106 每单位规定的保温时间
酶单位/升 = —————————×————————
·L·V标
实际保温时间
四、酶促反应进程
酶促反应进程曲线
酶量的测定：
通过酶活性测定间接测得酶的含量，因此，要准确测定酶量，应使酶浓度 （〔E〕）与酶促反应速度成正比，即〔E〕∝-d〔S〕/dt或〔E〕∝d〔P〕/dt。 能够真正代表酶活性大小的是线性期的酶促反应速度，即酶促反应初速度。
固定时间法
按照对酶促反应 时间的选择不同
连续监测法
（一）固定时间法
定义：测定酶促反应开始后一段时间内底物的减少量或产物的增加量。 分类：
终点法：在反应进行到预定时间后要终止反应。 两点法：该方法反应时间的预定是从t1～t2 。
特点： 优点是简单。 缺点是难以确定反应时间段酶促反应是否处于线性期。
惯用单位：酶活性测定方法的建立者所规定的单位。 国际单位 ：1IU指在规定条件（最适pH，最适底物浓度）下， 每分钟转化1mol底物的酶量。单位为IU/L 。 Katal单位：1Katal指在规定条件下，每秒钟转化1mol底物的 酶量，1Katal=60×106IU。
三、酶活性单位的计算
步骤：
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丙酮酸
0.017
D-葡萄糖
0.05
D-果糖
1.5
D-乳糖
4.0
H2CO3
9.0
H2O2
25
蔗糖
28
甘氨酰酪氨酰甘氨酸 108
2.反映酶与底物的亲合力
Km值越大，酶与底物亲合力越小， Km值越小，酶与底物亲合力越大。
3.选择酶的最适底物
Km值取决于酶的种类和底物的性质，在酶一定时，不同底 物有不同的Km值。酶活力测定时，应优先选择酶的最适底物， 使酶促反应容易进行，并节省底物用量。
1 Km +〔S〕 Km 1
1
—— = ————— = ——— · —— + ———
v Vmax〔S〕 Vmax 〔S〕 Vmax
2．Cornish-Bowden作图法 又称为直线线性作图法。
第二节 酶活性测定方法及酶学分析的类型
酶活性的测定方法 工具酶 酶偶联测定法 底物浓度测定
一、酶活性的测定方法
定义 ： Vmax指酶完全被底物分子饱和时的反应速度。
应用：
Vmax可用来计算酶的转化率（TN），即单位时间内每分子 酶可使底物发生化学反应的分子数，单位为分子数/秒。当反 应速度达到最大反应速度时，如果已知酶量，则可计算出酶的 转化率：
TN =底物转化量（mol/s）/酶量（mol）
(四)Km和Vmax的测定 1．Linweaver-Burk作图法,又称为双倒数作图法
上式中v代表反应速度，Vmax代表最大反应速度，〔S〕代表底物浓度，Km称为米氏 常数。
（一）米氏常数的定义
由米-曼氏方程可以导出：
（Vmax-v）〔S〕 Km = ———————
v
当v = 1/2Vmax时，Km =〔S〕。因此Km值为反应速度相当于 最大反应速度一半时的底物浓度。Km值是酶的特征常数，具有重 要的应用价值。
酶活性即酶促反应速度，指在规定条件下单位时间内底物的减少量或产
物的生成量。
v =-d〔S〕/dt 或 v =d〔P〕/dt。
底物浓度为〔S〕,产物浓度为〔P〕,时间为t，反应速度为v
注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的 生成量为好。
二、酶活性单位
定义：指在一定条件下使酶促反应达到某一速度时所需要的酶量。酶活性单 位是一个人为规定的标准。