猪血中高纯度血红素的提取工艺

猪血中高纯度血红素的提取工艺
【摘要】目的：确立最佳溶血方法，建立高产量、高纯度血红素提取工艺。

方法：新鲜抗凝猪血为原料，比较了水溶胀法、乙醇法以及超声波法对红细胞溶血效果，以盐酸丙酮配比，盐酸丙酮与溶血液体积比对猪血中血红素提取的影响。

结果：确立超声波法进行红细胞溶血，36.5%浓盐酸与丙酮的体积为1%的血红素抽提液，与溶血液的体积比为5∶1抽提10分钟，最终可从新鲜猪血中得到红素6.0 g/L，纯度达99.8%。

结论：用超声法溶血效果明显优于水溶胀法、乙醇法，溶血率达100%；36.5%浓盐酸与丙酮的体积比为1%的血红素抽提液，有利于规模化生产。

【关键词】猪血；血红素；超声波溶血；提取
探索酸性丙酮提取法制备血红素工艺中溶血方法、酸性丙酮及其与溶血液的比例对提取的影响，特别是超声波溶血与丙酮提取方法相结合，建立了快速、简便制备高产量和高纯度血红素的新工艺，为规模化生产提供依据。

1 材料与方法
1.1 材料与仪器：原材料：新鲜猪血，南京肉联厂提供。

试剂：血红素标准品(Sigma公司)，其他试剂均为分析纯。

主要仪器与设备：UV-8500型分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)；超声波细胞粉碎机（宁波新芝科器研究所）。

1.2 实验方法
1.2.1 工艺流程：新鲜抗凝猪血→离心→红血球→洗涤→溶血→加酸性丙酮于溶血液→抽提得血红素溶解液→滤液→真空浓缩→氢氧化钠纯化→干燥得血红素。

工艺要点：新鲜猪血加8 g/L柠檬酸三钠为抗凝剂，5 000 r/min，离心15分钟，收集红细胞，再用0.9%氯化钠溶液洗涤红细胞1次。

抽提后的血红素溶液采用真空浓缩并回收丙酮。

浓缩物采用0.1 mol/L NaOH溶解，3 000 r/min，离心10分钟收集上清液。

以1 mol/L盐酸调解pH值至4～5，沉淀血红素，收集沉淀并水洗至中性，50 ℃真空干燥至恒重得血红素。

1.2.2 溶血方法的比较：（1）水溶胀法：取25 ml红细胞，按照去离子水与红细胞溶液体积之比为0.5∶1、1∶1、1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1、3.0∶1，6个水平以400 r/min转速搅拌不同时间，用血球计数板计数红细胞破碎数量，比较
溶血率。

（2）乙醇溶血法：取25 ml红细胞，按照95%乙醇体积占红细胞溶液体积的10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%7个水平以400 r/min转，速搅拌30分钟，比较溶血率。

同1.2.2中（1）的方法。

（3）超声波溶血法：取25 ml 红细胞，加入0.5倍体积去离子水，用冰水浴在功率100W，200W，300W，400W，500W 5个水平下超声10分钟，比较溶血率。

同1.2.2中（1）的方法。

1.2.3 酸性丙酮溶液中浓盐酸与丙酮体积比的确定：（1）按照1.2.2中（3）的方法处理的红细胞溶血液，按酸性丙酮溶液与溶血液体积比4∶1的比例加入红细胞溶血液抽提10分钟，比较36.5％浓盐酸与丙酮体积比为0.5∶100、1∶100、2∶100、3∶100、4∶100、5∶100 5个水平的酸性丙酮溶液抽提效果。

抽提液经过滤、浓缩、纯化、干燥后计算每升猪血中血红素的提取量（g/L）。

1.2.4 抽提时间的确定：取按照1.2.2中（3）的方法处理的红细胞溶血液，按1.2.3方法确立的最佳条件加入4倍于溶血液体积的1％酸性丙酮（36.5％浓盐酸与丙酮的体积比），分别抽提4、6、8、10、12、14分钟。

过滤、浓缩、纯化、干燥后计算每升猪血中血红素的提取量（g/L）。

1.2.5 酸性丙酮与溶血液不同体积比对血红素抽提的影响：为了确定酸性丙酮与溶血液体积比，取按照1.2.2中（3）的方法处理的红细胞溶血液，按照酸性丙酮溶液与溶血液体积比为2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1比例混合，进行抽提，抽提时间按照1.2.4方法确立的最佳时间。

同1.2.3测定血红素提取量（g/L）。

1.2.6 血红素的纯化：将真空浓缩物用0.1 mol/L NaOH溶液溶解后离心，取上清液，以1 mol/L盐酸调解pH值至4～5，沉淀血红素，收集沉淀并水洗至中性，50 ℃真空干燥至恒重得血红素。

1.2.7 血红素含量与纯度测定：以0.1 mol/L NaOH溶解血红素标准样品和提取样品，调整至适宜浓度，参考文献[5]于波长385 nm处测定吸光度值，计算样品中血红素的含量及其纯度。

２结果
2.1 溶血方法的比较
2.1.1 水溶胀溶血法：在0～4℃下，加入不同体积的去离子水，比较水与红细胞不同比例（V/V）在搅拌不同时间的溶血效果，结果见表1。

2.1.2 乙醇溶血法：取洗净的红细胞加入不同体积倍数的无水乙醇，测定红细胞溶血效果。

结果无水乙醇的量越多，溶血效果越好；在无水乙醇量20％～30%之间，溶血率明显增加；当乙醇量为30％时，溶血率达95％以上；乙醇量在35％以上，细胞全部破碎。

这是因为一定浓度的乙醇可使红细胞细胞膜中蛋白质变性、溶解脂类成分而失去细胞膜结构，从而导致红细胞破碎。

2.1.3 超声波溶血法：取洗净的红细胞或加入0.5体积去离子水，在超声波不同功率下处理10分钟，观察溶血效果。

结果见图1。

综合三种溶血方法的优缺点，本研究确立采取超声波溶血法。

超声波溶血条件为取红血球加入等体积去离子水，以超声波400 W功率工用10分钟，溶血率达到100％。

2.2 酸性丙酮溶液中浓盐酸与丙酮体积比的确立：由于酸性丙酮的pH值不易测定，为了便于工业化大生产，因而比较加入36.5%浓盐酸与丙酮的不同体积比对提取血红素产量的影响。

结果见图2。

2.3 抽提时间的确立：取适量的溶血液，加入4倍于溶血液体积的1％酸性丙酮溶液（36.5％浓盐酸与丙酮的体积比）分别抽提4、6、8、10、12、14分钟，确立血红素提取的最适时间。

结果随着抽提时间增长，血红素产量不断升高，当抽提到10分钟时，血红素产量已经达6 g/L，但随着抽提时间的延长，血红素产量基本上不再增长。

从而确定最佳抽提时间为10分钟。

2.4 酸性丙酮与溶血液体积比对血红素产量的影响：取适量红细胞溶血液，按照酸性丙酮溶液与溶血液体积比为2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1五个水平加入1％酸性丙酮溶液（36.5％浓盐酸与丙酮的体积比）进行抽提10分钟，比较不同比例对血红素的提取量的影响。

结果见图3。

图3 酸性丙酮与溶血液不同比例对血红素提取量的影响
提取工艺的验证：按照已建立的血红素提取工艺重复试验５次，每次血红素的提取量及纯度见表２。

3 讨论
3.1 溶血方法：血细胞膜破裂或溶解后，就可分离出血红蛋白。

血细胞与适量水混合后，降低了细胞外渗透压，使血细胞吸水导致细胞膜胀裂，同时配以适量的机械作用，如搅拌等，可以提高破裂速度。

由于细胞膜中含有脂蛋白，故凡能使脂类溶解或改变脂类物理性状的物质如氯仿，乙醚等脂，脂溶剂皂盐，肥皂等乳化剂都能引起膜的脂双层破坏而溶血。

但加入有机溶剂，毒性大，特别是用了一定量氯仿，使细胞膜破裂和溶解同时进行，血红蛋白从血细胞中较完全地分离出来。

使用氯仿这种毒性溶剂，不但给血红素和副产品血红蛋白的后处理带来诸多不便，同时还损害操作者的身体健康。

并且可能造成环境污染。

此外，氯仿价格高，在很大程度上增加了生产成本。

本实验使用超声机械破壁，效果好，时间短，缩短了生产时间，降低了生产成本。

3.2 超声溶血时间对血红素产量的影响：血红素的收率和纯度并不是随着超声波溶血时间的增加而增加，而是在超声波溶血时间为10分钟时达到最大值.也就是说在0~10分钟范围内，氯化血红素的收率和纯度随着超声波溶血时间的增加而升高，在10分钟以后，血红素的收率和纯度随着超声波溶血时间的增加反而降低.这是因为超声波虽然有助于红细胞的破碎，但是超声波被吸收后还具有加热作用，有可能导致血红蛋白的部分变性凝聚，阻碍了血红素的释放，同样超声功率过高也有加热作用，进而影响了氯化血红素的纯度和收率。

综合考虑实际生产过程中的各种因素，如超声波产生的噪音，所消耗的电能和生产周期等因素，在以后的实验中，超声波溶血时间设定为10分钟。

3.3 pH对珠蛋白和血红素分离的关系：pH≤2.5时，亚铁血红素与珠蛋白的
结合最疏松，而珠蛋白的pI≈3.0，为在血红素与珠蛋白分离的同时，使珠蛋白沉淀，pH值应控制在3.0左右[1]。

本实验考虑有机溶剂状态下，pH值不易测定，确定了在红血球溶液加等体积水，然后加入5倍体积1%（V/V）浓盐酸丙酮。

操作方便，实现容易。

3.4 本工艺提取血红素方法的特点：血红素制备方法有许多种，传统方法以冰醋酸提取血红素[2，3]，1 L血液只可得3～4 g血红素，而且冰醋酸难回收，成本高，收率低，废液处理不当会造成环境污染。

用单宁酸法制备血红素纯度可在90%以上，但是收率低，每升红细胞只能得3～4 g血红素，且单宁酸价格昂贵，不适宜工业生产。

本工艺从新鲜猪血中可以获得血红素 6.0 g/L，纯度为99.8%，生产周期大约3小时，与其它的生产工艺相比，不但可以缩短生产周期(单宁酸法在10小时以上)，且纯度已经达到了99.8%。

本工艺提取的血红素的生产成本仅为2～4元/g，低于单宁酸法（5～7元/g）；更为重要的是避免使用毒性较大、成本较高的氯仿和吡啶，减少了对生产人员健康的危害，避免了因使用氯仿和吡啶所造成的环境污染，同时也简化了提取步骤，为充分利用我国丰富的猪血资源提供了切实可行的技术路线，有利于大规模化生产。

确定红细胞的溶血方法为取红血球加入等体积去离子水，以超声波400 W功率作用10分钟，溶血率达到100％。

建立血红素的提取工艺为36.5％浓盐酸与丙酮的体积比为1%的抽提液，其与加入等体积水超声波溶血液的体积比为5∶1抽提10分钟，再采用NaOH溶解、盐酸沉淀并水洗至中性，50 ℃真空干燥，最终可从新鲜猪血中得到血红素6.0 g/L，纯度达99.8%。

所建立的工艺简单，成本低廉，高效。

参考文献：
[1] 袁曦，洪清. 氯化血红素取工艺及质量标准研究[J]. 中国药学杂志，1997，32（6）：360.
[2] 宋照军，刘玺.血红素提取纯化新技术研究[J]. 广州食品工业科技，2003，20（1）：6.
[3] Hu W，Link H，Lang W. Preparation purification and characterization of Chlorohaemin [J]. Biol Chem Hoppe Seyler，1992，373(6):305.
[4] 钟耀广.利用冰醋酸提取血红素的研究[J]. 食品科学，2004，25（4）：90.。