重组子的筛选与鉴定.ppt
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• 指编码的产物能够使转化或转染的细胞在有选择 剂或营养缺乏的情况下很好生长或表现出其他可 视特征的基因。
• 构建载体时，目的基因与选择标记基因在载体上 的空间关系有两种： 1、独立存在。用于区分转化细胞与未转化细胞 2、目的基因插入选择标记基因编码区或其基因调 控部分。用于区分空载体转化细胞与重组载体转 化细胞
例
• 如pBR322质粒含有TC r、Amp r两个抗药性基因，外源基 因插入失活TC r后，会有三种不同表现的细胞:
• 未转化的受体细胞— TC sAmp s • 含载体的转化菌落－ Ampr Tcr • 含重组体的阳性菌落—Ampr Tcs
空载体转化菌落
空载体转化菌落及 重组载体转化菌落
筛选具体做法
2、λ噬菌体的cI基因的插入失活筛选
——cI筛选法
• 原理：cI基因编码的阻遏蛋白可使感染了λ噬菌体的大肠 杆菌进入溶原化状态； cI基因的插入失活使感染了λ噬菌 体的大肠杆菌由溶原状态进入溶菌状态。 重组噬菌斑：无色透明 非重组噬菌斑：浑浊 未转化菌：正常菌落
Polylinker插入不影响lacZ′基因表达
2、博来霉素抗性基因：zeocin
3、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因：gpt
黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT）
基因（ecogpt）选择系统
• 由大肠杆菌Ecogpt 基因编码的黄嘌呤-鸟嘌呤磷
酸核糖基转移酶（XGPRT）是一种核苷酸代谢酶， 能够把黄嘌呤转变为黄苷酸（XMP），并最终形 成鸟苷酸（GMP）。
1、用转化反应液涂布含氨苄的LB平板，长出转化子— Ampr ；
2、用无菌牙签将Ampr的转化子逐一挑在Tc平板上（或用 无菌丝绒布、无菌滤纸影印），比较两块板上的菌落生 长情况，从Amp板上挑选出Tc板上不长的菌落即为重组 子。
注意：氨苄平板菌落密度不宜过大
影印平板培养法
利用lacZ′基因的插入失活筛选重组子 —蓝白筛选法
lacZ ′基因插入失活筛选：蓝白筛选 cI基因插入失活筛选：cI筛选 利用Spi（sensitive to P2 inhibition）表型选择： Spi筛选
选择标记基因
1、利用lacZ′基因的插入失活筛选重组噬菌斑
• 如含有lacZ′基因的M13噬菌体及多种λ噬菌体载体（ λ gt11）
• 重组噬菌斑无色透明，非重组噬菌斑呈蓝色，未转化细 胞长出菌落
报告基因（reporter gene）
• 指载体上携带的、表达产物容易被检测且能够 指示外源基因导入受体细胞与否及表达水平的 基因。 • 构建载体时，一般将报告基因与目的基因融合， 并将报告基因置于目的基因启动子控制之下， 报告基因与目的基因同步转化与表达。
第二节、大肠杆菌重组体的筛选
一、质粒载体转化大肠杆菌细胞的筛选
替代途径
黄嘌呤
XMP GMP
XGPRT （＋）
HGPRT基因选择系统组成
1、受体细胞：普通哺乳动物细胞
2、载体：含有 gpt基因的载体，如 pAG4622（人-鼠嵌合轻链 表达载体） ，pSV2gpt （人-鼠嵌合重链表达载体）
lacZ基因编码β-半乳糖苷酶； lacZ′基因编码β-半乳糖苷酶的N端 序列α片段 ，互补菌染色体上携带的缺陷基因编码C端片断，两者 互补（α-互补）形成有功能的全酶。
蓝白筛选菌落生长照片
X-gal
• 5-Bromo-4-Chloro -3-Indoly- -D-Galactoside)，5-溴-4氯-3-吲哚--D-半乳糖苷
含Lac I 的载体：如pUC8，需要诱导物 不含Lac I 的载体：如pUC18/19，不需诱导物
研究中通常为何用IPTG而非乳糖作诱导物？ 乳糖会被宿主细胞利用而IPTG不被利用。
大肠杆菌乳糖操纵子基因组成 IPTG
例1:pUC8中lacZ′基因的插入失活
例二：pGEM-3Z中lacZ′基 因的插入失活
（二）Zeo选择系统
• Zeo是编码博来霉素抗性产物的基因。 • 博来霉素（ bleomycin）是一种光谱抗肿瘤药。
三、酵母其他显性标记基因
1、蓝白筛选基因：LacZ基因 2、 铜离子抗性蛋白基因：CUP1基因。编码一种铜离子螯
合蛋白，适合铜离子敏感菌（如酿酒酵母）的筛选。
3、赭石突变抑制基因：sup4
hfL：high frequence lysogenization
3、spi-筛选
用目的基因取代λ噬菌体取代型载体上含有redgam（整合 基因）的填充片段后，使噬菌体由red+gam+转变为red-gam-， 感染P2噬菌体溶源菌后使细菌由溶原生长转换为溶菌生长。 利用这种特性进行的筛选称为spi-筛选。
• 载体需携带his4，转染后的阳性重组子可以用不含组氨酸的
平板进行筛选
含URA3的载体及其相应的受体细胞
• 载体： 酵母菌的Yep系列载体：含Amp、Tc和URA3（尿嘧啶） 标记基因
• 受体细胞：EGY48菌株
Amp、Tc抗性基因用于在大肠杆菌中筛选重组子 URA3标记基因用于酵母转化细胞的筛选
• 载体同时含氨苄青霉素抗性基因和lacZ ′基因，外源 基因插在lacZ′基因内，受体细胞为lacZ ′基因互补菌。 在同时含氨苄青霉素和蓝白筛选显色剂（ X-gal）的 平板上筛选： 未转化细胞不能生长； 空载体转化菌长成蓝色菌落； 重组子长成白色菌落。 • 例：pUC质粒系列、pGEM质粒系列、M13噬菌体
第三节、转化/重组酵母菌的筛选
•营养缺陷互补基因 •显性标记基因
一、利用营养缺陷互补基因的筛选方法
• 原理：受体细胞为某种营养缺陷型突变株，即不 能合成某种营养成分，在缺乏该营养成分的培养 基上不能生长； • 携带相应营养成分合成基因的载体转化受体菌后， 使细胞在选择培养基（不含某种相应营养物质的 培养基）中能够生长，而未被转化的细胞不能生 长。
（一）抗生素平板结合插入失活筛选法—根据标记 基因是否失活，确定是否有外源基因插入。
插入失活筛选法的应用
两种情况： 双抗生素抗性基因标记载体 含一个抗生素抗性标记，一个lacZ′基因的载体
带双抗生素抗性标记的质粒载体转化大肠杆 菌的筛选方法
• 载体携带两个抗生素抗性基因，外源基因插入其中一个 基因内导致其失活，用两种抗生素平板筛选重组子。
red+gam+噬菌体可在P2噬菌体溶源菌中呈溶原生长， 被定为SPi+ （ sensitive to P2 inhibition，对P2介入敏感） red-gam-噬菌体在P2溶源菌中则呈溶菌生长，定为Spi-。
填充片段内含有red及gam基因的载体如EMBL3和EMBL4
三、杂交筛选
• 菌落或噬菌斑杂交筛选
• 胞内表达的载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K， pPICZ，pHWO10，pGAPZ， pGAPZa等
组氨醇脱氢酶基因（histidinol
dehydrogenase gene，his4）缺失的毕赤
酵母
• 主要有三类：GS115 、 SMDI168 、KM71 • 均不能合成组氨酸
NJU 重组子的筛选（screening） 与鉴定
第一节、有关概念
• 转化子 • 重组子 • 期望重组子 • 筛选 • 鉴定
转化子与非转化子
•转化子：接纳有外源DNA分子（载体 或重组分子）的受体细胞。
•非转化子：未接纳外源DNA分子的非 转化细胞。
重组子与非重组子
•重组子：含有重组DNA分子的 转化子。 •非重组子：仅含有空载体分子 的转化子。
二、 重组噬菌体DNA转入大肠杆菌后 重组子的筛选
（一）取代型载体：根据λ基因组的大小筛选，直接挑取 噬菌斑即重组子
• 机理： 空载体太小而不被包装，不进入细胞；重组λ-DNA可包 装成噬菌体颗粒并感染大肠杆菌产生噬菌斑；
未感染菌生长成菌落。
（二）插入型载体
• 空载体及重组载体都可包装，需要插入失活载体上的标 记基因筛选。
二、酵母常用显性标记基因
1、氨基糖苷类药物磷酸转移酶基因：Neo （neomycin）。 2、博来霉素抗性基因：Zeo（Zeocin）。如 pFLD1载体、
（一）Neo选择系统
• Neo基因编码氨基糖苷磷酸转移酶，可以灭活氨基糖 甙类抗生素，是新霉素（neomycin）、新霉素衍生 物G418、卡那霉素等抗生素的抗药基因。
• 第一步：正选择。在不进行插入失活抗性基因的相应抗 生素平板上转化子可以生长，非转化子不能生长，可将 转化子直接从平板上挑出来；
• 第二步：负选择。在插入失活抗性基因的相应抗生素平 板上转化子中的非重组子（未插入外源基因）可以生长， 重组子（插入外源基因）不能生长，应与第一种抗生素 板进行对照并在其上挑出含重组子的菌落。
（二）插入表达筛选
• 载体的选择标记基因前连接一段负调控序列，插 入失活负调控序列后，其下游的筛选标记基因才 能表达。
• 如pTR262质粒，在Tc（Tet）基因前有来自噬菌体的cI 基因，可编码cI阻遏蛋白，抑制Tet表达。
• cI基因（ HindⅢ或BglⅠ位点）插入失活，Tc基因表达， 受体细胞在Tc板上生长；未转化细胞及及空载体转化细胞 Tc表达被抑制，在Tc平板上不生长。
酵母常用营养标记基因
• 第一类：氨基酸合成基因：
组氨酸合成酶基因HIS4 色氨酸合成酶基因TRP1 亮氨酸合成酶基因LEU2 精氨酸合成酶基因 ARG4
第二类：核苷酸合成基因：
尿嘧啶合成酶基因（URA3）
例：含HIS的载体
• 分泌型表达载体主要有：pPIc9，pPIc9k，pHIL-S1， pPIcza，pYAM75P6；
2、含空载体的细胞（酶切 未切开或重新环化的载体 转化的细胞）
3、重组子：
（1）含目的重组DNA的细 胞
（2）含非目的重组DNA的 细胞
鉴定
• 对筛选出的重组子DNA进行进一步酶切、测序等，鉴定 是否为目的重组子及重组子DNA序列的正确性等。
选择标记基因（selectable marker gene）
上形成正常的白色菌落；
• sup4被外源基因插入失活后重组子呈红色。
YAC 载体带有trp 1、 leu 2和 his 3、 a3 以及 sup4
密码子改变成UAA的无义突变又叫赭石突变
第四节、转染的哺乳动物细胞筛选
一、哺乳动物细胞常用的选择标记基因
1、新霉素抗性基因： neo（neomycin）
期望重组子与非期望重组子
•期望重组子：含有外源目的基因的重 组子。 •非期望重组子：携带非目的基因的重 组子。
转化子、重组子、期望重组子关系
转化子 重组子 期望重组子
筛选（screening）
• 一般指从反应体 系细胞群中辨别
挑选出转化子或 重组子的过程。
• 反应体系细胞的组成：
1、不含外源DNA的受体细 胞
• 霉酚酸能抑制次黄嘌呤核苷酸脱氢酶的作用而阻断嘌呤 核苷酸的经典合成途径。
• 携带gpt的载体转化受体细胞后，使受体细胞在含霉酚酸
的HAT培养基中启动核苷酸合成替代途径，利用培养基 中补加的黄嘌呤合成GMP，得以存活。
合成GMP 的不同途径
正常途径（经典途径）
IMP
XMP
GMP
（次黄苷酸）霉酚酸（×） （黄苷酸） （鸟苷酸）
利用赭石突变抑制基因 sup4筛选重组酵母菌
• 酵母菌AB1380（与 YAC 载体配套）的胸腺嘧啶合成酶基
因带有一个赭石突变 ade 2-1，使其在基本培养基上形成
红色菌落，但在缺少某种营养素的选择培养基上不能生 长。
• 当带有赭石突变抑制基因 sup4 的空载体存在于细胞中时， 可抑制 ade 2-1基因的突变效应，该酵母菌在选择培养基
单酶切时有这种情况
噬菌斑
2、 cI基因插入失活筛选
• 例：λgt10 － BNNl02（C600hflA ）系统 • C600hflA是一种hflA突变菌；cI基因正常表达的 噬菌体在其中溶原生长，不形成噬菌斑；
但cI基因插入失活的重组噬菌体却能形成噬菌 斑（Young and Davis 1983a）。
• -半乳糖苷酶显色剂：生色底物
IPTG及其作用
• IPTG：即Isopropyl- -D-thioagalactoside，异丙 基- -D-硫代半乳糖苷 • 作用：乳糖操纵子诱导物，和载体上携带的大
肠杆菌乳糖操纵子的调节基因（Lac I ）编码产
物—阻遏蛋白结合，阻止其与操纵基因结合， 使操纵子控制的基因（lacZ等）得以表达。
• 构建载体时，目的基因与选择标记基因在载体上 的空间关系有两种： 1、独立存在。用于区分转化细胞与未转化细胞 2、目的基因插入选择标记基因编码区或其基因调 控部分。用于区分空载体转化细胞与重组载体转 化细胞
例
• 如pBR322质粒含有TC r、Amp r两个抗药性基因，外源基 因插入失活TC r后，会有三种不同表现的细胞:
• 未转化的受体细胞— TC sAmp s • 含载体的转化菌落－ Ampr Tcr • 含重组体的阳性菌落—Ampr Tcs
空载体转化菌落
空载体转化菌落及 重组载体转化菌落
筛选具体做法
2、λ噬菌体的cI基因的插入失活筛选
——cI筛选法
• 原理：cI基因编码的阻遏蛋白可使感染了λ噬菌体的大肠 杆菌进入溶原化状态； cI基因的插入失活使感染了λ噬菌 体的大肠杆菌由溶原状态进入溶菌状态。 重组噬菌斑：无色透明 非重组噬菌斑：浑浊 未转化菌：正常菌落
Polylinker插入不影响lacZ′基因表达
2、博来霉素抗性基因：zeocin
3、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因：gpt
黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT）
基因（ecogpt）选择系统
• 由大肠杆菌Ecogpt 基因编码的黄嘌呤-鸟嘌呤磷
酸核糖基转移酶（XGPRT）是一种核苷酸代谢酶， 能够把黄嘌呤转变为黄苷酸（XMP），并最终形 成鸟苷酸（GMP）。
1、用转化反应液涂布含氨苄的LB平板，长出转化子— Ampr ；
2、用无菌牙签将Ampr的转化子逐一挑在Tc平板上（或用 无菌丝绒布、无菌滤纸影印），比较两块板上的菌落生 长情况，从Amp板上挑选出Tc板上不长的菌落即为重组 子。
注意：氨苄平板菌落密度不宜过大
影印平板培养法
利用lacZ′基因的插入失活筛选重组子 —蓝白筛选法
lacZ ′基因插入失活筛选：蓝白筛选 cI基因插入失活筛选：cI筛选 利用Spi（sensitive to P2 inhibition）表型选择： Spi筛选
选择标记基因
1、利用lacZ′基因的插入失活筛选重组噬菌斑
• 如含有lacZ′基因的M13噬菌体及多种λ噬菌体载体（ λ gt11）
• 重组噬菌斑无色透明，非重组噬菌斑呈蓝色，未转化细 胞长出菌落
报告基因（reporter gene）
• 指载体上携带的、表达产物容易被检测且能够 指示外源基因导入受体细胞与否及表达水平的 基因。 • 构建载体时，一般将报告基因与目的基因融合， 并将报告基因置于目的基因启动子控制之下， 报告基因与目的基因同步转化与表达。
第二节、大肠杆菌重组体的筛选
一、质粒载体转化大肠杆菌细胞的筛选
替代途径
黄嘌呤
XMP GMP
XGPRT （＋）
HGPRT基因选择系统组成
1、受体细胞：普通哺乳动物细胞
2、载体：含有 gpt基因的载体，如 pAG4622（人-鼠嵌合轻链 表达载体） ，pSV2gpt （人-鼠嵌合重链表达载体）
lacZ基因编码β-半乳糖苷酶； lacZ′基因编码β-半乳糖苷酶的N端 序列α片段 ，互补菌染色体上携带的缺陷基因编码C端片断，两者 互补（α-互补）形成有功能的全酶。
蓝白筛选菌落生长照片
X-gal
• 5-Bromo-4-Chloro -3-Indoly- -D-Galactoside)，5-溴-4氯-3-吲哚--D-半乳糖苷
含Lac I 的载体：如pUC8，需要诱导物 不含Lac I 的载体：如pUC18/19，不需诱导物
研究中通常为何用IPTG而非乳糖作诱导物？ 乳糖会被宿主细胞利用而IPTG不被利用。
大肠杆菌乳糖操纵子基因组成 IPTG
例1:pUC8中lacZ′基因的插入失活
例二：pGEM-3Z中lacZ′基 因的插入失活
（二）Zeo选择系统
• Zeo是编码博来霉素抗性产物的基因。 • 博来霉素（ bleomycin）是一种光谱抗肿瘤药。
三、酵母其他显性标记基因
1、蓝白筛选基因：LacZ基因 2、 铜离子抗性蛋白基因：CUP1基因。编码一种铜离子螯
合蛋白，适合铜离子敏感菌（如酿酒酵母）的筛选。
3、赭石突变抑制基因：sup4
hfL：high frequence lysogenization
3、spi-筛选
用目的基因取代λ噬菌体取代型载体上含有redgam（整合 基因）的填充片段后，使噬菌体由red+gam+转变为red-gam-， 感染P2噬菌体溶源菌后使细菌由溶原生长转换为溶菌生长。 利用这种特性进行的筛选称为spi-筛选。
• 载体需携带his4，转染后的阳性重组子可以用不含组氨酸的
平板进行筛选
含URA3的载体及其相应的受体细胞
• 载体： 酵母菌的Yep系列载体：含Amp、Tc和URA3（尿嘧啶） 标记基因
• 受体细胞：EGY48菌株
Amp、Tc抗性基因用于在大肠杆菌中筛选重组子 URA3标记基因用于酵母转化细胞的筛选
• 载体同时含氨苄青霉素抗性基因和lacZ ′基因，外源 基因插在lacZ′基因内，受体细胞为lacZ ′基因互补菌。 在同时含氨苄青霉素和蓝白筛选显色剂（ X-gal）的 平板上筛选： 未转化细胞不能生长； 空载体转化菌长成蓝色菌落； 重组子长成白色菌落。 • 例：pUC质粒系列、pGEM质粒系列、M13噬菌体
第三节、转化/重组酵母菌的筛选
•营养缺陷互补基因 •显性标记基因
一、利用营养缺陷互补基因的筛选方法
• 原理：受体细胞为某种营养缺陷型突变株，即不 能合成某种营养成分，在缺乏该营养成分的培养 基上不能生长； • 携带相应营养成分合成基因的载体转化受体菌后， 使细胞在选择培养基（不含某种相应营养物质的 培养基）中能够生长，而未被转化的细胞不能生 长。
（一）抗生素平板结合插入失活筛选法—根据标记 基因是否失活，确定是否有外源基因插入。
插入失活筛选法的应用
两种情况： 双抗生素抗性基因标记载体 含一个抗生素抗性标记，一个lacZ′基因的载体
带双抗生素抗性标记的质粒载体转化大肠杆 菌的筛选方法
• 载体携带两个抗生素抗性基因，外源基因插入其中一个 基因内导致其失活，用两种抗生素平板筛选重组子。
red+gam+噬菌体可在P2噬菌体溶源菌中呈溶原生长， 被定为SPi+ （ sensitive to P2 inhibition，对P2介入敏感） red-gam-噬菌体在P2溶源菌中则呈溶菌生长，定为Spi-。
填充片段内含有red及gam基因的载体如EMBL3和EMBL4
三、杂交筛选
• 菌落或噬菌斑杂交筛选
• 胞内表达的载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K， pPICZ，pHWO10，pGAPZ， pGAPZa等
组氨醇脱氢酶基因（histidinol
dehydrogenase gene，his4）缺失的毕赤
酵母
• 主要有三类：GS115 、 SMDI168 、KM71 • 均不能合成组氨酸
NJU 重组子的筛选（screening） 与鉴定
第一节、有关概念
• 转化子 • 重组子 • 期望重组子 • 筛选 • 鉴定
转化子与非转化子
•转化子：接纳有外源DNA分子（载体 或重组分子）的受体细胞。
•非转化子：未接纳外源DNA分子的非 转化细胞。
重组子与非重组子
•重组子：含有重组DNA分子的 转化子。 •非重组子：仅含有空载体分子 的转化子。
二、 重组噬菌体DNA转入大肠杆菌后 重组子的筛选
（一）取代型载体：根据λ基因组的大小筛选，直接挑取 噬菌斑即重组子
• 机理： 空载体太小而不被包装，不进入细胞；重组λ-DNA可包 装成噬菌体颗粒并感染大肠杆菌产生噬菌斑；
未感染菌生长成菌落。
（二）插入型载体
• 空载体及重组载体都可包装，需要插入失活载体上的标 记基因筛选。
二、酵母常用显性标记基因
1、氨基糖苷类药物磷酸转移酶基因：Neo （neomycin）。 2、博来霉素抗性基因：Zeo（Zeocin）。如 pFLD1载体、
（一）Neo选择系统
• Neo基因编码氨基糖苷磷酸转移酶，可以灭活氨基糖 甙类抗生素，是新霉素（neomycin）、新霉素衍生 物G418、卡那霉素等抗生素的抗药基因。
• 第一步：正选择。在不进行插入失活抗性基因的相应抗 生素平板上转化子可以生长，非转化子不能生长，可将 转化子直接从平板上挑出来；
• 第二步：负选择。在插入失活抗性基因的相应抗生素平 板上转化子中的非重组子（未插入外源基因）可以生长， 重组子（插入外源基因）不能生长，应与第一种抗生素 板进行对照并在其上挑出含重组子的菌落。
（二）插入表达筛选
• 载体的选择标记基因前连接一段负调控序列，插 入失活负调控序列后，其下游的筛选标记基因才 能表达。
• 如pTR262质粒，在Tc（Tet）基因前有来自噬菌体的cI 基因，可编码cI阻遏蛋白，抑制Tet表达。
• cI基因（ HindⅢ或BglⅠ位点）插入失活，Tc基因表达， 受体细胞在Tc板上生长；未转化细胞及及空载体转化细胞 Tc表达被抑制，在Tc平板上不生长。
酵母常用营养标记基因
• 第一类：氨基酸合成基因：
组氨酸合成酶基因HIS4 色氨酸合成酶基因TRP1 亮氨酸合成酶基因LEU2 精氨酸合成酶基因 ARG4
第二类：核苷酸合成基因：
尿嘧啶合成酶基因（URA3）
例：含HIS的载体
• 分泌型表达载体主要有：pPIc9，pPIc9k，pHIL-S1， pPIcza，pYAM75P6；
2、含空载体的细胞（酶切 未切开或重新环化的载体 转化的细胞）
3、重组子：
（1）含目的重组DNA的细 胞
（2）含非目的重组DNA的 细胞
鉴定
• 对筛选出的重组子DNA进行进一步酶切、测序等，鉴定 是否为目的重组子及重组子DNA序列的正确性等。
选择标记基因（selectable marker gene）
上形成正常的白色菌落；
• sup4被外源基因插入失活后重组子呈红色。
YAC 载体带有trp 1、 leu 2和 his 3、 a3 以及 sup4
密码子改变成UAA的无义突变又叫赭石突变
第四节、转染的哺乳动物细胞筛选
一、哺乳动物细胞常用的选择标记基因
1、新霉素抗性基因： neo（neomycin）
期望重组子与非期望重组子
•期望重组子：含有外源目的基因的重 组子。 •非期望重组子：携带非目的基因的重 组子。
转化子、重组子、期望重组子关系
转化子 重组子 期望重组子
筛选（screening）
• 一般指从反应体 系细胞群中辨别
挑选出转化子或 重组子的过程。
• 反应体系细胞的组成：
1、不含外源DNA的受体细 胞
• 霉酚酸能抑制次黄嘌呤核苷酸脱氢酶的作用而阻断嘌呤 核苷酸的经典合成途径。
• 携带gpt的载体转化受体细胞后，使受体细胞在含霉酚酸
的HAT培养基中启动核苷酸合成替代途径，利用培养基 中补加的黄嘌呤合成GMP，得以存活。
合成GMP 的不同途径
正常途径（经典途径）
IMP
XMP
GMP
（次黄苷酸）霉酚酸（×） （黄苷酸） （鸟苷酸）
利用赭石突变抑制基因 sup4筛选重组酵母菌
• 酵母菌AB1380（与 YAC 载体配套）的胸腺嘧啶合成酶基
因带有一个赭石突变 ade 2-1，使其在基本培养基上形成
红色菌落，但在缺少某种营养素的选择培养基上不能生 长。
• 当带有赭石突变抑制基因 sup4 的空载体存在于细胞中时， 可抑制 ade 2-1基因的突变效应，该酵母菌在选择培养基
单酶切时有这种情况
噬菌斑
2、 cI基因插入失活筛选
• 例：λgt10 － BNNl02（C600hflA ）系统 • C600hflA是一种hflA突变菌；cI基因正常表达的 噬菌体在其中溶原生长，不形成噬菌斑；
但cI基因插入失活的重组噬菌体却能形成噬菌 斑（Young and Davis 1983a）。
• -半乳糖苷酶显色剂：生色底物
IPTG及其作用
• IPTG：即Isopropyl- -D-thioagalactoside，异丙 基- -D-硫代半乳糖苷 • 作用：乳糖操纵子诱导物，和载体上携带的大
肠杆菌乳糖操纵子的调节基因（Lac I ）编码产
物—阻遏蛋白结合，阻止其与操纵基因结合， 使操纵子控制的基因（lacZ等）得以表达。