关于核酸分子杂交七年制课件

32P或35S同位素标记 的单核苷酸
dig-dUTP的结构
（1）缺口平移法（nicktranslation）
由DNA酶Ⅰ和大肠 杆菌DNA聚合酶Ⅰ 共同完成。
DNA酶Ⅰ：在双链 DNA上随机打开若 干个单链缺口，产 生3’-OH端
大肠杆菌DNA聚合 酶Ⅰ：5’→3’DNA聚 合酶活性； 5’→3’ 外切核酸酶活性
影响核酸分子杂交的因素
•探针的浓度、长度、复杂性 •离子强度 •温度与变性剂（甲酰胺） •杂交条件的严谨性
5’
3’
5’
3’
3’
5’
3’
5’
预杂交prehybridization
概念：为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异 性结合，在杂交前用封闭物将这些非特异性位点封闭。 这一杂交前的处理过程称为预杂交。
常用的封闭物： （1）变性的非特异性DNA:如鲑鱼精DNA、小牛胸腺DNA， 又称为覆盖DNA。 （2）高分子化合物：Denhardt溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小 牛血清白蛋白、聚蔗糖400 、脱脂奶粉
基本实验步骤：
electrophoresis
Transfer Block
hybridization
（3）探针的末端标记：在5’或3’端通过酶促反应加上标记物 酶切
核酸探针检测方法
同位素标记探针：放射自显影检测杂交信号
放射自显影是指利用放射线在x线片的成影作用来 检测杂交信号。
取出杂交膜，在Whatman滤纸上晾干，用保鲜膜 包好，在暗室中置于X线片上，加增感屏，固定于暗盒 内，-70℃曝光适当时间（1-7天），在暗室中取出X线 片，显影、定影，即可在X线片上读出杂交带。
常用的探针标记法：
（1）化学标记法：光敏生物素标记法
（2）酶促标记法： 将标记物预先标记在核苷酸分子上，然后
利用酶学的方法将标记物掺入到探针分子上。 切刻平移法、随机引物法、末端标记法等
光敏生物素标记法:强光10-20分钟，光敏基团与核酸探针的
磷酸基团以共价键结合。
（2）酶促标记法： 将标记物预先标记在核苷酸分子上，然后利用酶学的 方法将标记物掺入到探针分子上。 缺口平移法、随机引物法、末端标记法等
甲酰胺是一种变性剂，能干扰碱基堆积力和氢键的形成，
– M为Na+摩尔浓降度低，核n酸为杂探交针的的T复m值杂，性50%的甲酰胺可以使Tm降低30℃
例如，一个长度为500bp的探针，（G+C）含量为 50%，杂交体系中含5 X SSC（0.75mol/L Na+）和50% 甲酰胺，则其Tm值为：
Tm=81.5℃ + (-2.07) + 20.5 – 1 – 30.5=68.4 ℃ –50%甲酰胺溶液, 温度一般选择低于 Tm值20-25℃ –杂交温度应:68.4 ℃ - 25 ℃=43.2 ℃
第一节 核酸分子杂交的基本原理
一、变性（denaturation） 二、复性（renaturation） 三、杂交（hybridization） 四、预杂交（prehybridization）
基本原理：DNA变性、复性与分子杂交
Hybridization
Tm ：50%DNA解链的温度，又称融解温度。 （G、C含量）Tm = 69.3 + 0.41*(G +C) %
Tm=4 ℃ X（G + C）+ 2℃ X（A + T）
融解温度：50％杂 化核酸分子解链温 度称为寡核苷酸探 针的Tm值。
寡核苷酸探针的长 度、碱基的含量和 核酸的序列决定了 探针的Tm值。
实际操作中，常选 择低于Tm值5-10℃ 进行杂交。
杂交温度：
– Tm=81.5℃ + 161.6logM + 0.41（G + C）% - 500/n - 0.61（甲酰胺%）
“边切除、边聚合”
➢最合适的缺口平移片段一般为50-500个核苷酸。
➢DNA酶Ⅰ的用量和E.coli DNA聚合酶Ⅰ的质量会影响产 物片段的大小。
➢DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性, 故应使 用仔细纯化后的DNA。
（2）随机引物法 （random priming）
随机引物（4-6nt）：含 有各种可能排列顺序的寡 核苷酸片段的混合物。
46=4096
DNA聚合酶ⅠKlenow片段：
5’→3’DNA聚合酶活性
弱3’→5’外切核酸酶活性
无5’→3wk.baidu.com外切核酸酶活性
➢产物平均长度为400-600个核苷酸。
➢Klenow片段没有5 ’ →3’外切酶活性, 反应稳定, 可以获 得大量的有效探针。
➢反应时对模板的要求不严格, 用微量制备的质粒DNA模 板也可进行反应。
非放射性标记探针：偶联反应+显色反应
Dig：半抗原，可通过抗原抗体反应系统与显色体系偶联
Dig-DNA探针
+
抗Dig抗体-碱性磷酸酶（AP） 或辣根过氧化物酶（HRP）
+
底物 ：BCIP+NBT 蓝紫色 或 DAB 红棕色； TMB 蓝色
关于核酸分子杂交 七年制
• 核酸分子杂交（nucleic acid molecular hybridization） 是指用标记的已知DNA或RNA片段检测样品中 未知核酸序列，通过碱基互补配对原则发生同 源性结合，再经显影或显色的方法，将结合的 核酸序列的位置或大小显示出来。
• 探针( probe )：带有可检测标记的已知序列的 DNA或RNA片段。
Migration
blocksubstrate probe
第二节 核酸探针
probe：带有可检测标记的已知DNA或RNA片段， 用于检测待测样品中的靶核酸序列。
➢ 核酸探针的类型 ➢ 核酸探针的标记方法 ➢ 核酸探针的检测
核酸探针的类型
按化学本质分：DNA探针 RNA探针
按标记物分：放射性标记探针 3H、32P、35S、125I等 优点：高特异性，高灵敏度 缺点：存在放射性污染，半衰期短 非放射性标记探针 生物素，地高辛、荧光素等
➢检测对象: 克隆化的基因组DNA,、细胞总DNA、总RNA。 杂交方法不同，被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞 内杂交, 即细胞原位杂交。
➢核酸分子杂交特点：高度的灵敏性(pg) 、高度的特异性
➢应用：克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定 基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。目前核酸 分子杂交不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用, 而且在 临床基因诊断上的应用也日趋增多。