常用基因检测方法原理与局限
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• 借助毛细管电泳，检测待测物（通常为PCR扩增 产物）中是否有特定长度（范围）DNA片段出现
• 无法检测出序列内部的碱基改变
– 例如“SRY基因片段分析”项目：提取样本总DNA后，用 SRY基因特异引物进行PCR扩增，并将扩增产物进行 毛细管电泳，观察是否有目标长度的扩增产物
• 片段分析的应用范围广泛
以下为全染色体组UPD的 CMA结果
• 对样本目标序列进行甲 基化特异性PCR后，印 迹（DNA甲基化状态） 不同的序列会发生碱基 的改变，并扩增得到长 短不一的片段
• 借助毛细管电泳，检 测待测物（通常为 PCR扩增产物）中是 否有特定长度DNA片 段出现
低通量检测：“有的放矢”
Байду номын сангаасSanger 测序
染色体显带技术，Chromosome banding
G显带染色体核型分析技术仍然是细胞遗传学产前诊断 的“金标准”
• 应用范围
– 使染色体大小和形态一目了然,特别是发生在染色体上的遗传 疾病，如染色体倒位、易位、互换和短缺，都可以及时发现, 有利于临床诊断
• 局限性
– 细胞培养耗时长、分辨率低以及耗费人力
– 对自然流产、胎死宫内、新生儿死亡等妊娠书产撕物成的一遗页传一学页检的测
– 可以检测出同源性单亲二倍体（UPD）再能拿检去查校出对页，码就装不订
• 局限性
错误了
– 无法检出染色体倒位,易位,互换等结构变异
相当于升级版的核型分析，能查到比 普通核型分析更加细小的拷贝数改变 以及单亲二倍体。
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• 线粒体遗传病：呈母系遗传 （复习：母系
遗传=患病女性所有子女都患 病？）
没有一种药包治百病，如果有， 那就是毒药
没有哪一种检测方法能够搞定所有的 事情，如果有，那就是忽悠
复习
• 遗传病的基因检测，本质上就是以参考基因为 基准，对样本基因进行校对
• 碱基
• 外显子
字句 段落
书册
• 染色体
章节
常用基因检测方法原 理与局限
单击此处添加副标题
陈白雪 Oct. 31, 2018
• 染色体病：染色体畸变引起 • 单基因遗传病
• 常染色体显性遗传：携带杂合致病突 变即可发病。
• 常染色体隐性遗传：携带纯合致病突 变或复合杂合突变才能发病。
• 伴X连锁遗传 • 伴Y连锁遗传
• 多基因遗传病：多基因、环 境因素联合作用导致疾病发 生
– 对线粒体病无能为力
报告单出现类似右边的图 像→_→ 就是核型报告 有该项目疑问请咨询 @陈帆 @吴梦华
47，XX，+21
染色体微阵列分析
Chromosome microarray analysis, CMA
• 应用范围
– 儿童复杂、罕见遗传病，如：智力障碍、生长发育迟缓、多发畸形、 孤独症样临床表现，排除染色体病、代谢病和脆性X综合征之后的 全基因组CNV检测 （包括智力低下、发育迟缓、多种体征畸形以 及自闭症中，CMA比传统G显带核型分析技术的检出率提高了10％）
Thanks.
• 探针与待检测基因序列进行特异性杂交，通过探 针的连接、PCR扩增，收集数据并进行分析
• 可应用于缺失、重复突变检测，主要针对基因外 显子。
• 亦可用于分析特定的点突变（通常是热点突变）， 前提是试剂盒里已经有针对该突变设计的探针
技术原理
扩增产物毛 细管电泳结 果
MLPA探针 结构
片段分析（Fragment Analysis，FA）
MLPA
FA
已知微小突变
√
√
×
未知微小突变
√
×
×
大片段重复/缺 失
×
√
√*
UPD（单亲双 体）
×
×
√
* ：FA分动析态大突片变段缺失需要√**明确具体×缺失范围，√而MLPA 只需要明确基因即可
猜中“有奖” 猜不中“白 折腾”
**：理论上Sanger测序也能数动态突变重复单位个数，但 人工数易出错，且当片段过长时容易超出Sanger测序分析 的范围。
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PWS/AS：CMA or FA？？？
CMA
FA
核基因组全局分析
√
×
仅检测患者，区分 PWS/AS
×
√
仅检测患者，区分 LOH/UPD
√
×
对于首选片段分析（FA）方法的 PWS/AS患者，先做3370项目（协 助确诊）。
• 染色体 片段
一代测序/Sanger测序
• 经典的直接测序方法，基因 突变检测的“金标准”
• 检测范围：
– 细胞核基因 – 线粒体基因
• 检测精度：20个以内碱基 的替换、缺失、重复
• 局限性
– 仅适用于目标基因明确的 单基因遗传病检测
Sanger测序应用举例
多重连接酶依赖性探针扩增技术（MLPA）
片段分析（Fragment Analysis，FA）
可用于单亲二倍体/LOH的检 测
• 一对染色体分别来自父 母。当缺失了其中一方 来源的染色体（LOH）， 或者是某一对染色体同 时来自父或母亲的一方 （单亲二倍体，UPD）
• UPD可以发生在局部， 也可发生于整个染色体组
• 如果发生在染色体“印迹 区”，则可导致疾病发生
若结果为阳性，可以再做3381（协 助判断预后）
“下一代”测序技术 Next-generation sequencing , NGS
• 优势：能同时对无数条DNA分子进行序列测定，效率极高 • 技术特点：每次测很短的片段（读长较短），但是可以通过超
大量的平行测序，获得大量的序列。
（某个位点的）深度： 这个位点被测的次数 read(s)：测序直接得出 的短序列
√
√
√*
大片段缺失/重复 >=3M >=100k ×**
结构改变
√
×
×
单亲二倍体 （UPD）
×
√
×
标本培养
√
×
×
* ：仅限于全基因组测序能做到核基因组全局分析，若只
是全外显子组或者Gene Panel则不行。
保证中彩 票头奖的 方法：
把所有号 码都买了
**：不能保证检出，若检出则需经过其他实验（例如 MLPA）验证 。
相当于把几本一样的书撕碎了（一份 DNA溶液里面有无数条DNA分子）。再 叫一堆人（一个人就是一个read），每 人发一个碎片校对。 由于撕碎是随机的，会有N个人校对到同 一个句子（N=深度）。一个地方被校对 的次数越多，校对结果准确性就越高。
高通量检测：“鸟枪法”
核型分析 CMA NGS
核基因组全局分 析
• 无法检测出序列内部的碱基改变
– 例如“SRY基因片段分析”项目：提取样本总DNA后，用 SRY基因特异引物进行PCR扩增，并将扩增产物进行 毛细管电泳，观察是否有目标长度的扩增产物
• 片段分析的应用范围广泛
以下为全染色体组UPD的 CMA结果
• 对样本目标序列进行甲 基化特异性PCR后，印 迹（DNA甲基化状态） 不同的序列会发生碱基 的改变，并扩增得到长 短不一的片段
• 借助毛细管电泳，检 测待测物（通常为 PCR扩增产物）中是 否有特定长度DNA片 段出现
低通量检测：“有的放矢”
Байду номын сангаасSanger 测序
染色体显带技术，Chromosome banding
G显带染色体核型分析技术仍然是细胞遗传学产前诊断 的“金标准”
• 应用范围
– 使染色体大小和形态一目了然,特别是发生在染色体上的遗传 疾病，如染色体倒位、易位、互换和短缺，都可以及时发现, 有利于临床诊断
• 局限性
– 细胞培养耗时长、分辨率低以及耗费人力
– 对自然流产、胎死宫内、新生儿死亡等妊娠书产撕物成的一遗页传一学页检的测
– 可以检测出同源性单亲二倍体（UPD）再能拿检去查校出对页，码就装不订
• 局限性
错误了
– 无法检出染色体倒位,易位,互换等结构变异
相当于升级版的核型分析，能查到比 普通核型分析更加细小的拷贝数改变 以及单亲二倍体。
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• 线粒体遗传病：呈母系遗传 （复习：母系
遗传=患病女性所有子女都患 病？）
没有一种药包治百病，如果有， 那就是毒药
没有哪一种检测方法能够搞定所有的 事情，如果有，那就是忽悠
复习
• 遗传病的基因检测，本质上就是以参考基因为 基准，对样本基因进行校对
• 碱基
• 外显子
字句 段落
书册
• 染色体
章节
常用基因检测方法原 理与局限
单击此处添加副标题
陈白雪 Oct. 31, 2018
• 染色体病：染色体畸变引起 • 单基因遗传病
• 常染色体显性遗传：携带杂合致病突 变即可发病。
• 常染色体隐性遗传：携带纯合致病突 变或复合杂合突变才能发病。
• 伴X连锁遗传 • 伴Y连锁遗传
• 多基因遗传病：多基因、环 境因素联合作用导致疾病发 生
– 对线粒体病无能为力
报告单出现类似右边的图 像→_→ 就是核型报告 有该项目疑问请咨询 @陈帆 @吴梦华
47，XX，+21
染色体微阵列分析
Chromosome microarray analysis, CMA
• 应用范围
– 儿童复杂、罕见遗传病，如：智力障碍、生长发育迟缓、多发畸形、 孤独症样临床表现，排除染色体病、代谢病和脆性X综合征之后的 全基因组CNV检测 （包括智力低下、发育迟缓、多种体征畸形以 及自闭症中，CMA比传统G显带核型分析技术的检出率提高了10％）
Thanks.
• 探针与待检测基因序列进行特异性杂交，通过探 针的连接、PCR扩增，收集数据并进行分析
• 可应用于缺失、重复突变检测，主要针对基因外 显子。
• 亦可用于分析特定的点突变（通常是热点突变）， 前提是试剂盒里已经有针对该突变设计的探针
技术原理
扩增产物毛 细管电泳结 果
MLPA探针 结构
片段分析（Fragment Analysis，FA）
MLPA
FA
已知微小突变
√
√
×
未知微小突变
√
×
×
大片段重复/缺 失
×
√
√*
UPD（单亲双 体）
×
×
√
* ：FA分动析态大突片变段缺失需要√**明确具体×缺失范围，√而MLPA 只需要明确基因即可
猜中“有奖” 猜不中“白 折腾”
**：理论上Sanger测序也能数动态突变重复单位个数，但 人工数易出错，且当片段过长时容易超出Sanger测序分析 的范围。
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PWS/AS：CMA or FA？？？
CMA
FA
核基因组全局分析
√
×
仅检测患者，区分 PWS/AS
×
√
仅检测患者，区分 LOH/UPD
√
×
对于首选片段分析（FA）方法的 PWS/AS患者，先做3370项目（协 助确诊）。
• 染色体 片段
一代测序/Sanger测序
• 经典的直接测序方法，基因 突变检测的“金标准”
• 检测范围：
– 细胞核基因 – 线粒体基因
• 检测精度：20个以内碱基 的替换、缺失、重复
• 局限性
– 仅适用于目标基因明确的 单基因遗传病检测
Sanger测序应用举例
多重连接酶依赖性探针扩增技术（MLPA）
片段分析（Fragment Analysis，FA）
可用于单亲二倍体/LOH的检 测
• 一对染色体分别来自父 母。当缺失了其中一方 来源的染色体（LOH）， 或者是某一对染色体同 时来自父或母亲的一方 （单亲二倍体，UPD）
• UPD可以发生在局部， 也可发生于整个染色体组
• 如果发生在染色体“印迹 区”，则可导致疾病发生
若结果为阳性，可以再做3381（协 助判断预后）
“下一代”测序技术 Next-generation sequencing , NGS
• 优势：能同时对无数条DNA分子进行序列测定，效率极高 • 技术特点：每次测很短的片段（读长较短），但是可以通过超
大量的平行测序，获得大量的序列。
（某个位点的）深度： 这个位点被测的次数 read(s)：测序直接得出 的短序列
√
√
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大片段缺失/重复 >=3M >=100k ×**
结构改变
√
×
×
单亲二倍体 （UPD）
×
√
×
标本培养
√
×
×
* ：仅限于全基因组测序能做到核基因组全局分析，若只
是全外显子组或者Gene Panel则不行。
保证中彩 票头奖的 方法：
把所有号 码都买了
**：不能保证检出，若检出则需经过其他实验（例如 MLPA）验证 。
相当于把几本一样的书撕碎了（一份 DNA溶液里面有无数条DNA分子）。再 叫一堆人（一个人就是一个read），每 人发一个碎片校对。 由于撕碎是随机的，会有N个人校对到同 一个句子（N=深度）。一个地方被校对 的次数越多，校对结果准确性就越高。
高通量检测：“鸟枪法”
核型分析 CMA NGS
核基因组全局分 析