抗氧化活性研究方法.ppt

二.自由基的产生及抗氧化的重要性
自由基对人体造成的伤害 抗氧化剂
天然植物
三.检测方法
? 目前常用的抗氧化活性检测方法主要基于以下机理： ? (1)在特定条件下，样品对检测体系中脂类物质的氧化抑
制能力反映被测物的抗氧化活性；（TBARS法） ? (2)在特定条件下，样品对检测体系中自由基的清除能力
反映被测物的抗氧化活性；（DPPH自由基的清除） ? (3)在特定条件下，测定样品的还原能力反映被测物的抗
氧化活性。（还原Fe3+）
四.DPPH法
1.原理
DPPH(二苯代苦味酰基自由基) 是一种以氮为中心的稳 定自由基。 特点：醇溶液呈紫色，波长为517nm下具有最大吸收。 具有单一电子，故能接受一个电子或氢离子，有自由基 清除剂存在时，DPPH的单电子被捕捉而使其颜色变浅， 在最大光吸收波长处的吸光值下降,吸光度水平的降低 表明抗氧化性的增加，从而以评价试验样品的抗氧化能 力。此抗氧化能力用抑制率来表示，抑制率越大，抗氧 化性越强。
实验步骤
2.实验步骤
? 将样品用甲醇配制成一系列浓度,取0.15mL样品加入 2.85mLABTS自由基工作液，混合，放置10min后,在734nm 处测定吸光度。每份样品平行操作3次。
? 计10算0％公式为：清除率(％)=[A(溶剂)- A(样品)] /A（溶剂） ×
?
AA（（溶样剂品））
为2.85 mLABTS溶液与0.15mL甲醇混合后的吸度， 为2.85mLABTS溶液与0.15mL样品混合后的吸光度。
1.原理
以水溶性的ABTS+自由基引发剂为显色剂。 特点：ABTS与过硫酸钾反应生成稳定的蓝/绿色阳离子自 由基ABTS+，最大吸光波长为734nm。 向ABTS+其中加入被测物质，如果该物质中存在抗氧化成 分，则该物质会与ABTS+发生反应而使反应体系褪色，然 后在ABTS+这种自由基的734nm吸光波长下检测吸光度的变 化来反映物质的抗氧化能力。
ABTS法优缺点
3.优缺点
简便，快速，适合于大量样品的检测。 ABTS在与氢原子供体的反应中选择性差是此法的一个不足 ，它可与任何羟基化的芳香族化合物反应，这与它们的实 际抗氧化能力关，因此,TEAC值也包括对抗氧化不起作用 的羟基。
六.TBARS 法
简介
脂质体系中氧化反应抑制或中止的判断主要通过测量被氧 化物的浓度，氧的去除或氧化产物的形成。因此，反应物 (不饱和脂肪酸，自由基等)的消失，氧化产物的定量可能 是判断氧化阶段的最合适方法。通过直接或者间接检测氧 的消失和自由基的电子自旋光谱，适用于氧化过程的初始 阶段。通常采用TBARS法来评价脂质的过氧化.
VitE清除DPPH自由基抗氧化量效曲线
（相关系数）
反应时间t为30min的量效曲线
实验步骤
（2）一般方法——紫外分光光度计法 将样品用甲醇配制成一系列浓度，取0.1mL样品加入3.5 mL DPPH甲醇溶液(0.06 mmwk.baidu.coml/L)，混合30min后测定515 nm处吸光度。每份样品平行操作3次。
抗氧化活性研究方法
以酶标法清除DPPH自由基为主
目录
? 一.检测抗氧化活性的原因
? 二.自由基的产生及抗氧化的重要性
? 三.检测方法 ? 四.DPPH法（原理，一般方法，酶标法） ? 五.ABTS法 ? 六.TBARS法 ? 七.铁离子还原能力(FRAP)
一.检测抗氧化活性的原因
1.天然植物中许多化学物质具有抗氧化活性 2.抗氧化剂有延缓衰老等功效，越来越受到人们关注 3.据文献记齐墩果酸型三萜有较好的抗氧化活性 4.抗氧化活性测试简单，快捷，经济
计算公式为:清除率(％)=[A(溶剂)- A(样品)]/A（溶剂） x100％
酶标法优势
3.酶标法优势
抗氧化微孔板实验方法的优势：①耗材量少，试剂量以微 升计；②试剂种类少，部分试剂配制可交互使用；③方法 简便，耗时短；④可重复性强，可以广泛应用于药物筛选， 特别是高通量药物筛选研究。
五.ABTS法
七.铁离子还原能力 (FRAP)
原理
FRAP的原理是基于氧化还原反应的比色法。在酸性条件下， Fe3+一TPTA(Fe3+—三吡啶三嗪)被抗氧化剂还原成Fe2+一 TPTZF，溶液变成深蓝色，并且在593nm处有强吸收。FRAP 法具有快速、简便、重复性好等优点。该法不仅用于检测 食物及饮料的抗氧化活性。也可用于检测纯天然抗氧化剂 的活性。
实验步骤
2.实验步骤
（1）酶标法检测——酶标仪 ? 取96孔细胞培养板，各孔分别加入150μ mol·L- 1的DPPH
溶液180μ L,各浓度梯度样品溶液20μ L,终浓度分别为3.9 ~500μ mol·L- 1，反应总体积200μ L,以溶剂作对照。加 样后，振荡混匀。封板胶封板后，室温下避光静置。分别 在10~120min时间范围内于517nm处测定各孔吸光度值。观 察样品抗DPPH的时效量效变化过程，确定实验的稳定性和 最佳实验反应时间。
? 计算公式为:清除率(％)=[A(溶剂)- A(样品)]/A（溶剂） x100％
VitE清除DPPH自由基抗氧化量效曲线
30min
10-120min内,随着 作用时间的延长 VitE抗DPPH作用增 强，但在3.931.2μ mol·L- 1范 围内，各时间点的 药效变化不明显， 62.5-500μ mol·L-1 浓度范围，随着浓 度增加，各时间点 的药物作用曲线逐 渐分离，并在 500μ mol·L-1，各 时间点量效趋于平 稳。从图中可以看 出，在这些时间点 中，30min的量效曲 线基本呈斜线上升。