药物在肝微粒体酶的体外代谢研究
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• 复合：药物首先与氧化型细胞色素P450 Fe3+结合成复合物。 • 还原：P450 Fe3+-药物接受还原辅酶Ⅱ提供的电子，由辅酶Ⅱ细胞色素 C还原酶传递，还原成P-450 Fe2+药物。 • 接受一分子氧：P450 Fe2+药物中的低铁血红素能与分子氧结合。 • 再接受电子还原： O2—P—Fe2+—药物再接受两个电子，由NADPH提供 或由还原辅酶Ⅰ供给，NADH-细胞色素b5还原酶传递，激活分子氧成 两个离子氧。 • 氧化：一个离子氧使药物氧化，另一个与氢结合成水。同时，P450Fe2+失去一个电子，而氧化再生成P450- Fe3+ 。因此可被反复利用用而 起催化作用。
体外代谢表型的鉴定, In vitro metabolic phenotype identification）
• 3. 如新药前体被肝脏显著代谢，其代谢产物是什么，其毒性或药效如何？ （即体外代谢产物的鉴定, In vitro metabolite identification） • 4. 新药前体是否能抑制或诱导肝脏药物代谢酶系，进而影响其它药物的药效 和安全？（即体外抑制评价和诱导评价, In vitro inhibition or induction study） • 5. 新药前体在何种动物代谢特征与人相似，进而为临床前研究的动物选择提 供依据？（即体外人和动物代谢特征研究 , In vitro metabolism profiling in animals and humans）
结果计算
• 将孵育0 min时间点待测化合物的浓度作为100%，其他孵育时间点的 浓度转换为百分剩余量，将各时间点的百分剩余量的自然对数对孵育 时间作线性回归，求算得斜率k，根据公式，T1/2 = - 0.693/k可以计算 得到体外半衰期。肝微粒体中的清除率（CL, mL· min−1· mg−1）= 0.693 / t1/2 (min) × 孵育液 (mL) / 肝微粒体 (mg) 。
常用体外代谢半衰期（T1/2）和固有清除率（CLint）表示。一般通过定
量测定目标化合物在酶孵育体系中的清除情况来计算。
孵育系统
• 每 个 孵 育 体 系 总 体 积 为 200 µ L ， 体 系 包 括 0.1 M 的 PBS 缓 冲 液
（pH=7.4）188 µ L，NADPH发生系统12 µ L。冰浴上将1 ～ 2 µ L的药
药物与P450酶的关系
• 酶的底物（substrates ）：由P450酶代谢 • 酶的抑制剂（inhibitors）：药酶活性减弱，使其他药物或 本身代谢减慢,占代谢性相互作用的70%
• 酶的诱导剂（inducers）：药酶活性增强，使其他药物或
本身代谢加速，占代谢性相互作用的23%
主要的P450酶
代谢表型
• 代谢表型指特定代谢酶对目标化合物代谢相对贡献的测算，以确定参
与药物代谢的主要酶，为预测个体差异和药物-药物相互作用提供依据。
理想的候选化合物的代谢转化是由多种酶介导，并且不是由一个高度 多态性的酶介导。代谢表型主要测定方法包括重组酶、选择性化学抑
制剂、抗体抑制剂三种方法wk.baidu.com其中选择性化学抑制剂法以其操作简单、
成本低等优势被广泛应用。
代谢表型实验和结果计算
• 本研究的目的是利用肝微粒体体外代谢孵育体系，通过底物消除法，测定加 入不同选择性化学抑制剂后对药物的代谢消除的影响，考察在肝微粒体中参 与代谢化合物的主要CYP450酶。 数据计算：用待测物的消除速率表示药物在微粒体孵育体系中的代谢速率； 抑制率(%)=（1-加入抑制剂样品代谢速率/阳性对照样品代谢速率） ×100%=[1-（阴性对照组浓度-实验组浓度）/（阴性对照组浓度-阳性对照组 浓度）]×100%
• 涉及药物代谢的 CYP主要为CYP1、CYP2、CYP3 3个家族中7种重要
的 亚 型 ： CYP1A2 、 CYP2B6 、 CYP2C9 、 CYP2C19 、 CPY2D6 、
CYP2E1和CYP3A4
常见P450抑制剂和诱导剂
代谢稳定性评价
• 代谢稳定性考察的是化合物被代谢的难易程度和体外清除率的大小，
物加入孵育体系中，在37 ℃水浴中预热5 min；然后冰浴上加入5 µ L 的肝微粒体酶，轻轻混匀，置于37 ℃水浴中孵育，在0min ～ 60min
设置5、6个时间点采集样品。待反应完毕之后加入400 µ L含内标的冰
甲醇溶液终止反应。实验中加入孵育体系中的药物体积控制在 1% 以 内，以防止溶解药物的有机溶剂对肝微粒体有灭活作用。
间，没有加药物的孵育体系作为空白对照进液质分析，分析鉴定代谢
产物。
药物对P450主要酶的抑制和诱导
• 酶抑制和诱导作用是代谢研究的关键，是预测药物-药物相互作用，
评估药物安全性的主要指标。一般通过考察药物对各种酶特异性底物
药物在肝微粒体酶的体外代谢研究
色谱小组：汤明海 2016.04.28
药物研发过程中可能会遇到的问题
• • 在进行新药（包括中药）研发的历程中，您可能会面临和解决这样的问题: 1. 新药前体是否被肝脏药物代谢酶系统代谢，造成口服生物利用度低下？ （即体外代谢稳定性评价,In vitro metabolic stability study） • 2. 如果新药前体被肝脏显著代谢，是何种酶系参与该新药前体的代谢？（即
90.00 80.00 70.00 60.00
•
抑制率%
50.00 40.00 30.00
20.00
10.00 0.00 CYP1A2 CYP2A6 CYP2C9 CYP2C19 CYP2D6 CYP2E1 表型 CYP3A4
代谢产物的鉴定
• 采用代谢稳定性一致的孵育体系，通过加一定浓度的药物孵育一定时
P450酶
• 肝微粒体酶中最主要的是细胞色素 P450(Cytochrome P450) 氧化酶，
简称P450酶，酶蛋白中所含血红素与一氧化碳（CO）的结合体P450CO在450 nm处有特征性强吸收峰而得名。它存在于肝细胞内质网中， 是一个酶系统。可催化数百种药物的氧化过程。
P450酶氧化药物的过程
体外代谢表型的鉴定, In vitro metabolic phenotype identification）
• 3. 如新药前体被肝脏显著代谢，其代谢产物是什么，其毒性或药效如何？ （即体外代谢产物的鉴定, In vitro metabolite identification） • 4. 新药前体是否能抑制或诱导肝脏药物代谢酶系，进而影响其它药物的药效 和安全？（即体外抑制评价和诱导评价, In vitro inhibition or induction study） • 5. 新药前体在何种动物代谢特征与人相似，进而为临床前研究的动物选择提 供依据？（即体外人和动物代谢特征研究 , In vitro metabolism profiling in animals and humans）
结果计算
• 将孵育0 min时间点待测化合物的浓度作为100%，其他孵育时间点的 浓度转换为百分剩余量，将各时间点的百分剩余量的自然对数对孵育 时间作线性回归，求算得斜率k，根据公式，T1/2 = - 0.693/k可以计算 得到体外半衰期。肝微粒体中的清除率（CL, mL· min−1· mg−1）= 0.693 / t1/2 (min) × 孵育液 (mL) / 肝微粒体 (mg) 。
常用体外代谢半衰期（T1/2）和固有清除率（CLint）表示。一般通过定
量测定目标化合物在酶孵育体系中的清除情况来计算。
孵育系统
• 每 个 孵 育 体 系 总 体 积 为 200 µ L ， 体 系 包 括 0.1 M 的 PBS 缓 冲 液
（pH=7.4）188 µ L，NADPH发生系统12 µ L。冰浴上将1 ～ 2 µ L的药
药物与P450酶的关系
• 酶的底物（substrates ）：由P450酶代谢 • 酶的抑制剂（inhibitors）：药酶活性减弱，使其他药物或 本身代谢减慢,占代谢性相互作用的70%
• 酶的诱导剂（inducers）：药酶活性增强，使其他药物或
本身代谢加速，占代谢性相互作用的23%
主要的P450酶
代谢表型
• 代谢表型指特定代谢酶对目标化合物代谢相对贡献的测算，以确定参
与药物代谢的主要酶，为预测个体差异和药物-药物相互作用提供依据。
理想的候选化合物的代谢转化是由多种酶介导，并且不是由一个高度 多态性的酶介导。代谢表型主要测定方法包括重组酶、选择性化学抑
制剂、抗体抑制剂三种方法wk.baidu.com其中选择性化学抑制剂法以其操作简单、
成本低等优势被广泛应用。
代谢表型实验和结果计算
• 本研究的目的是利用肝微粒体体外代谢孵育体系，通过底物消除法，测定加 入不同选择性化学抑制剂后对药物的代谢消除的影响，考察在肝微粒体中参 与代谢化合物的主要CYP450酶。 数据计算：用待测物的消除速率表示药物在微粒体孵育体系中的代谢速率； 抑制率(%)=（1-加入抑制剂样品代谢速率/阳性对照样品代谢速率） ×100%=[1-（阴性对照组浓度-实验组浓度）/（阴性对照组浓度-阳性对照组 浓度）]×100%
• 涉及药物代谢的 CYP主要为CYP1、CYP2、CYP3 3个家族中7种重要
的 亚 型 ： CYP1A2 、 CYP2B6 、 CYP2C9 、 CYP2C19 、 CPY2D6 、
CYP2E1和CYP3A4
常见P450抑制剂和诱导剂
代谢稳定性评价
• 代谢稳定性考察的是化合物被代谢的难易程度和体外清除率的大小，
物加入孵育体系中，在37 ℃水浴中预热5 min；然后冰浴上加入5 µ L 的肝微粒体酶，轻轻混匀，置于37 ℃水浴中孵育，在0min ～ 60min
设置5、6个时间点采集样品。待反应完毕之后加入400 µ L含内标的冰
甲醇溶液终止反应。实验中加入孵育体系中的药物体积控制在 1% 以 内，以防止溶解药物的有机溶剂对肝微粒体有灭活作用。
间，没有加药物的孵育体系作为空白对照进液质分析，分析鉴定代谢
产物。
药物对P450主要酶的抑制和诱导
• 酶抑制和诱导作用是代谢研究的关键，是预测药物-药物相互作用，
评估药物安全性的主要指标。一般通过考察药物对各种酶特异性底物
药物在肝微粒体酶的体外代谢研究
色谱小组：汤明海 2016.04.28
药物研发过程中可能会遇到的问题
• • 在进行新药（包括中药）研发的历程中，您可能会面临和解决这样的问题: 1. 新药前体是否被肝脏药物代谢酶系统代谢，造成口服生物利用度低下？ （即体外代谢稳定性评价,In vitro metabolic stability study） • 2. 如果新药前体被肝脏显著代谢，是何种酶系参与该新药前体的代谢？（即
90.00 80.00 70.00 60.00
•
抑制率%
50.00 40.00 30.00
20.00
10.00 0.00 CYP1A2 CYP2A6 CYP2C9 CYP2C19 CYP2D6 CYP2E1 表型 CYP3A4
代谢产物的鉴定
• 采用代谢稳定性一致的孵育体系，通过加一定浓度的药物孵育一定时
P450酶
• 肝微粒体酶中最主要的是细胞色素 P450(Cytochrome P450) 氧化酶，
简称P450酶，酶蛋白中所含血红素与一氧化碳（CO）的结合体P450CO在450 nm处有特征性强吸收峰而得名。它存在于肝细胞内质网中， 是一个酶系统。可催化数百种药物的氧化过程。
P450酶氧化药物的过程