铜绿假单胞菌产生耐药性的机制

D O I：10.3969/j.issn. 1005-1678. 2016. 12.058

铜绿假单胞菌产生耐药性的机制

孟鑫，尚德静&

(辽宁师范大学生命科学学院，辽宁大连116081)

[摘要]铜绿假单胞菌鳳s aeru扣而a，_P.aeru扣而a)与其它革兰氏阴性菌相比，其外膜渗透性低，并且多种耐药机制 协同作用，更容易表现出对大多数抗生素极低的易感性，从而加入了 “超级细菌”的行列。最近使用突变体库筛选，微阵列技术和突 变频率分析已经证实在体内生长条件或复杂的适应条件下（如b io film生长或群体迁移），抗生素本身也能够诱发非常大的基因团簇 突变从而导致耐药性以及新的适应性抗性。

[关键词]铜绿假单胞菌耐药性适应性抗性

[中图分类号]R453.2 [文献标识码]A

Mechanism of drug resistance of P seudom onas aeruginosa

MENG Xin, SHANG De-jingA

(Faculty of Life Science,Liaoning Normal University,Dalian 116081 ,China)

[A b s t r a c t]Pseudomonas aeruginosa exhibits an inherently reduced susceptibility to most antibiotics compared with most other Gram-negative bacterial species because its low outer membrane permeability and the multiple ways in which P. aeruginosa can become drug-resistant. Pseudomonas has joined the “super bacteria”. Recent researches, using mutant library screening, microarray technology, and mutation frequency analysis have demonstrated that antibiotics themselves can induce very large groups of genes in vivo growth conditions or complex adaptation conditions ( for example, biofilm growth or swarming motility) , resulting in resistance as well as new forms of adaptive resistance.

[K e y w o r d s] Pseudomonas aeruginosa；resistance ；adaptive resistance

自临床引人抗生素并滥用抗生素以来，细菌具有越来越复 杂的耐药性，导致“超级细菌”的出现和扩散，几乎对市场上所有 可用的抗菌药物都有一定的抗性。铜绿假单胞菌

aeru扣而a)是革兰氏阴性细菌，可以广泛感染动植 物宿主[1]，常见的医院感染中有10 ~ 15%是由其引起的[2]，主要 引起了囊性纤维化(cystic fibrosis，CF)患者的慢性肺部感染[33]。此夕卜，P.aerugi/WMa是呼吸机相关性肺炎（ventilator associated pneumonia,VAP)最常见的致病菌之一[5_6]，_P.引起的肺炎，常常导致急性肺损伤和继发性脓毒症，造成高死亡率[7_11]。

与其他病原体相比，对多种抗生素（包括氨基 糖苷类，氟喹诺酮类和P-内酰胺类）显示出较强的内源性抗性。例如:对羧苄青霉素的内源性抗性使得大多数P-内酰胺类（包括 美罗培南而非亚胺培南）抗生素的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentmtion，MIC)增加4 倍；对非p-内酰胺抗生素 如喹诺酮，甲氧苄氨嘧啶，四环素和氯霉素也有一定的内源性抗

作者筒介:孟鑫，女，硕士在读，研究方向:分子遗传学,E-m ail: 1317302082@ ;尚德静，通信作者，女，博士，教授，博士生导师，研究方向：生物化学与分子生物学，E-mail :djshang@ lnnu. edu. cn。性。这种内源性抗性主要源于其极低的外膜渗透性或外排系统 被激活产生的去抑制作用。f*.外膜中存在大量无效的成孔蛋白，限制了抗生素分子穿人细胞的速度[12]，使得次级 适应性抗性机制能更有效地运行，如增加外排功能和酶对抗生 素的修饰。

这些内在机制是遗传组成的一部分，可以通 过突变来稳定或增强，有些突变影响耐药性基因的表达及产物 的活性从而导致M IC变大，使许多常见的抗生素对P. aeragimwa没有效果，其他突变可能轻微地增加耐药性，使P. aeragmosa在大多数抗生素作用下的易感性逐渐降低，此外，一些菌株还可以通过水平转移（即菌株之间）抗性基因决定簇增加 耐药性。

除了内源性抗性这种比较传统的耐药机制，近年来发现P. aeragiraosa对不断变化的环境条件和胁迫有很强的适应性，也可 以引起对抗生素的适应性抗性，如接触抗生素，改变培养基条件 或改变生长状态等[13]，这种适应性抗性的现象早就报道过，然 而，最近才研究其对临床问题的广泛适用性。

虽然抗生素对多数由aeragimwa引起的感染有效，但是 其仍可以通过多种方式产生耐药性，导致耐药率不断增加，加之

其内源的高耐药性，使得开发新的药物非常具有挑战性。为此，了解P.aeragiTMwa产生耐药性的机制是非常重要的，本文描述 了有关耐药机制的最新发现，并分析抗生素在临 床治疗的相关现象。

1内源性耐药

P.对大多数的抗生素，如青霉素G、氨基青霉素，第一代和第二代头孢菌素等(3-内酰胺类药物具有天然耐药性，与其他革兰氏阴性细菌相比，野生型的A的外膜渗透性低（比大肠杆菌的渗透性低12 ~ 100倍），使其对抗生素具 有极低的易感性。革兰氏阴性细菌的外膜是抵制抗生素人侵的 选择性屏障[12]，常常被比作分子筛，大多数亲水性分子通过细 菌细胞外膜上通道蛋白的水分子扩散进人细菌，所以扩散效率 与抗生素分子的体积大小有关。aeragiTiosa细胞外膜中成孔 蛋白 F(Outer membrane channel proteins F,OprF)数量较少，所形 成的大的通道数量少，因此其对抗生素分子的进人具有很大的 限制，而其它形成小体积通道的成孔蛋白如外膜通道蛋白D (Outer membrane channel proteins D,OprD)和外膜通道蛋白 B (Outer membrane channel proteins B,OprB)仅允许小体积的抗生 素分子通过，还有些特异性成孔蛋白如OprD,允许碳青霉烯类抗 生素摄人;某些阳离子抗菌肽可以通过自我促进方式横过疏水 的双分子外膜。虽然低外膜渗透性影响了药物大幅度摄取，但 亲水分子可以在几秒钟内横跨外膜，达到内外平衡，说明P.

除了具有高内源耐药性，可能还有其它耐药机制，如 适应性机制:外排泵被诱导表达，引起药物加速外排;抗性结瘤 细胞分裂（resistant n o d u le c e ll d iv is io n，RND)系统 M e x A B-O p rM 和M e x X Y-O p r M的表达，以及A m p C(—种由_P. aeru扣而a的染 色体或质粒介导产生的一类p-内酰胺酶，属p-内酰胺酶A m b le r 分子结枸分类法中的c类）p-内酰胺酶的产生也有助于降低抗 生素跨外膜流动[14]。

此外，生物膜（biological film,biofilm)本身就具有抵制抗生 素的能力。最近的研究提出了 b w film的抗性作用的几种方式: 第一，bw film基质可以充当扩散性渗透的屏障，阻止抗生素到达 其靶位;第二，b w film内的微环境使细菌生长缓慢，例如还原氧 区;第三，b io film内的细菌亚群似乎分化为持久性细菌，大大降 低了对抗生素的易感性;最后，b w film内存在几种特异性调节的 抗性基因。

最近，通过对导致抗生素敏感性增加的突变体的突变体库 筛选研究[1519]，提出了 P.对抗生素内源性抗药的几种新机制。即来自不同功能类的几十个基因可参与突变，并且 这种突变形成了基因团簇的一部分。例如，突变株在许多基因 中可以影响D N A的复制、重组及修复，从而显示对环丙沙星敏 感性增加。有趣的是，细胞分裂基因fts K中的突变对环丙沙星 和P-内酰胺也有抗性作用[1618]。同样地，参与藻酸盐合成的基 因突变对P-内酰胺亚胺培南的易感性增加™。

目前，在用亚抑制或致死浓度抗生素治疗的微阵列实验中 观察到失调基因和耐药性基因之间的重叠，这表明f*.适应性地激活防御机制以抵御抗生素的抑制作用。这些研究共 同证明了 f*.aeragiTiosa的高耐药性是几种同时作用的机制最终 作用的结果，其潜在的机制可能会在临床结果中发挥重要作用。

2获得性耐药

2.1不同菌株间的水平转移（horizontal transfer)除内源 的高耐药性之外，还可通过部分可遗传性状增加耐 药性[21]。获得性耐药的两种类型包括遗传元件的水平转移和 突变性。DNA元件（包括质粒，转座子，整合子，原噬菌体等）可 以携带并且能够通过接合、转化或转导的方式获得抗生素抗性 基因，从而增加抗生素抗性，甚至由于质粒包含多个抗性盒而具 有多药耐药性[22]。这种水平转移主要增强了 P.aerngmoM对氨 基糖苷类和P-内酰胺类的抗性，对其它几类抗生素也有一定影 响，例如:可移动遗传元件上的氨基糖苷修饰酶灭活氨基糖苷 类，导致氨基糖苷类的各种化学修饰，同时引起30S核糖体亚基 (氨基糖苷类的主要耙标）亲和力降低[22]。一些aeragiTiosa 菌株除了有AmpC p-内酰胺酶外，还获得了编码新的p-内酰胺 酶的质粒[23,从而对青霉素和头孢菌素产生耐药性，因此，P. aeragimMa对p-内酰胺抗生素获得性耐药的主要机制是p-内酰 胺酶的产物对P-内酰胺类抗生素有抗性。目前，令人关注的是 质粒介导的广谱p-内醜胺酶（extended-spectrum p-lactamases, ESBLS)的增殖和金属-p-内醜胺酶（metal-beta-lactamase,MBL)对碳青霉烯类的灭活。

2.2突变性获得性耐药的第二种形式是突变。细菌在 胁迫条件下存活的关键机制之一是自发突变[16]，对付某个单一 抗生素的自发突变频率是1〇_6至1〇_9。但在D N A损伤剂的存在 下或在b io film的生长期间，突变率可以进一步增加[25_3°]，例如：当细菌与亚抑制浓度的环丙沙星预孵育时，美罗培南的突变频 率增加了十倍;在WoElm生长期间，抗氧化酶下调导致D N A损 伤增加，被biofilm包被的细菌对环丙沙星抗性的突变频率与浮 游细胞相比增加了 1〇〇倍以上，另外b w film包被的细菌在休眠 细胞持续发育等因素影响下对抗生素抗性增加1〇〇〇倍;此外，抗生素抗性分离株的出现主要与D N A错配修复系统中的突变 相关，由于错配修复基因mutS，m utL和D N A氧化修复系统基因 m utT和m utY中的突变引发了超强突变体，通常在C F患者中发 现，它们通过增加P-内酰胺酶和MexCD-OprJ外排泵的表达量增 强抗生素抗性[3133]。相关的研究还揭示了 P.aerngmoM外膜蛋 白O prD中含有亚胺培南结合点的环2和环3中的任何突变都 能引起构象变化导致碳青霉烯抗性。

P.—旦发生“突破”突变，能导致外排泵过度表达，抗生素摄取减少，P-内酰胺酶超量合成以及抗生素靶点改变，使抗生素失效[34]。aeragimwa临床分离株中编码MexR 阻遏蛋白的染色体基因发生突变（即m exR突变），促进mexA- mexB-oprM操纵子转录，使MexA-MexB-OprM过量表达从而对美 罗培南易感性降低[35]。另外，由于m exZ突变，MexXY-OprM过 表达导致f*.临床菌株对氨基糖苷，氟喹诺酮和头孢吡肟产生抗性;特异性孔蛋白O prD中的突变降低了抗生素亚胺