发酵法生产维生素C的综述

发酵法生产维生素C的综述

摘要：维生素C（英语：Vitamin C，又称L-抗坏血酸）是高等灵长类动物与其他少

数生物的必需营养素。抗坏血酸在大多的生物体可借由新陈代谢制造出来，但是人类是最显著的例外。最广为人知的是缺乏维生素C会造成坏血病。在生物体内，维生素C是一种抗氧化剂，保护身体免于自由基的威胁，维生素C同时也是一种辅酶。其广泛的食物来源为各类新鲜蔬果。

维生素C（英语：Vitamin C，又称L-抗坏血酸）为酸性己糖衍生物，是稀醇式己糖酸内酯，Vc主要来源新鲜水果和蔬菜，是高等灵长类动物与其他少数生物的必需营养素。Vc有L-型和D-型两种异构体，只有L-型的才具有生理功能，还原型和氧化型都有生理活性。

其结构是一种含有6个碳原子的酸性多羟基化合物，分子式为C6H8O6，分子量为176.1。

天然存在的抗坏血酸有L型和D型2种，后者无生物活性。维生素C是呈无色无臭的片状晶体，易溶于水，不溶于有机溶剂。在酸性环境中稳定，遇空气中氧、热、光、碱性物质，特别是由氧化酶及痕量铜、铁等金属离子存在时，可促进其氧化破坏。氧化酶一般在蔬菜中含量较多，故蔬菜储存过程中都有不同程度流失。但在某些果实中含有的生物类黄酮，能保护其稳定性。

0 前言

维生素C的发酵是指通过发酵作用将原料转化为维生素C，再通过生物分离技术将其从发酵液中分离提纯，获取满足要求的维生素C产品。维生素C的发酵过程中包含菌种的培育、菌种的保藏、种子的制备、发酵动力学、发酵环节的控制和染菌及防治六个方面。概括地说，在发酵的整个过程中要选育出优秀的发酵菌种并采取合理有效的方法予以保藏，保持其优良性状；在实际生产时要对菌种进行扩大培养，满足生产上对发酵菌的数量要求；对于发酵还应全面的考虑发酵的消耗、产率问题，并通过适当的控制方法提高效率；染菌和污染是发酵过程中的一个非常严重的问题，需要严格控制，频繁检测确保发酵罐安全，避免或较小损失。

1 发酵机制

目前，维生素C发酵主要有葡萄糖发酵和山梨醇发酵，工业中使用的发酵方法分别为莱氏法和二步发酵法。

1.1葡萄糖发酵

葡萄糖发酵是以葡萄糖为原料生产维生素C的发酵方法。该方法包括莱氏法、新二步发酵法和一步发酵法，但后两种由于技术等原因尚未应用到生产中，这里将简要介绍介绍一下。

氏法是一种化学合成与一步发酵相结合的生产方法，生产工艺路线成熟，生产原料便宜易得，产品

质量好，收率高。因此至今瑞士的Roche、日本的Takeda、德国的E.Merk和BASF等国外生产维生素的主要公司均采用该方法。该方法生产工序多、过程长，难以连续化操作；使用大量有毒、易燃化学药品，造成环境污染等。为此，自上世纪60年代开始，世界各地的科学家都致力于简化该生产路线的研究。[1,20,21]其合成路线如图1。

图1. 莱氏合成路线

新二步发酵法（相对于二步发酵法而言，将在后面对二步发酵法进行介绍）也称葡萄糖串联发酵法，是由D-葡萄糖依次经欧文氏菌、棒杆菌发酵生成维生素C。该法工序简单，但在原料和菌体处理等方面均有待改进提高，尚未能应用到工业生产中去。

一步发酵法是在新二步发酵法的基础上，利用生物技术，采用重组DNA技术，构成工程菌，实现从D-葡萄糖到2-KGL的一步发酵。[1]目前，该方法尚处于研究之中。

1.2 山梨醇发酵

山梨醇发酵上世纪70年代初，我国的尹光琳等发明了二步发酵法的新工艺，它是目前唯一成功应用于VC工业生产的微生物转化法[1]，是通过生物发酵得到2-酮-L-古洛糖酸，这有别于莱氏合成法中的化学合成，其发酵成分较莱氏合成法更多。[20-22]其发酵路线如图2（仅为发酵过程的一部分，其余过程与莱氏法相同）。

图2. 二步发酵法发酵路线

本文将以D-葡萄糖为开端，重点介绍二步发酵生产维生素C的过程，其中包括菌种的培育、菌种的保藏、种子的制备、发酵动力学、发酵环节的控制和染菌及防治等方面的内容。

2 菌种的培育

二步发酵生产维生素C过程中用到的菌系为混合菌系[23]，包含的发酵菌种类很多，这里将主要介绍巨大芽孢杆菌菌种的培育。（由于生黑醋杆菌的相关资料查不到，这里就不进行论述了，可以考虑从相关机构或科研院所直接获取现成的生黑醋酸杆菌，这也是获取菌种的一种方法）。

2.1菌种特性

巨大芽孢杆菌：杆状，末端圆；单个或呈短链排列，1.2～1.5×2.0～4.0微米；能运动；芽孢1.0～1.2×1.5～2.0微米，椭圆形，中生或次端生；能够液化明胶慢、胨化牛奶、水解淀粉、不还原硝酸；巨大芽孢杆菌为产孢杆菌，且为革兰氏阳性菌及好氧菌，也为常见的油中腐生菌。

2.2 菌种的分离

从巨大芽孢杆菌的特性分析，可以从腐败的食用油中分离巨大芽孢杆菌。具体方法是取适量腐败食用油，将其放入适合巨大芽孢杆菌生长的培养液中剧烈震荡，使其中的细菌大量进入到培养液中稀释溶液到适当的倍数，在合适的培养基上涂布、培养，长出纯的的单菌落，对单菌落中细菌进行分析，确定巨大芽孢杆菌。分离培养基成分（%）：酵母膏 0.3、牛肉膏 0.3、玉米浆 0.3、蛋白胨 1.0、KH2PO4 0.1、MgSO4 0.04、尿素 0.1、CaCO3 0.1、山梨糖 2.0、琼脂 2.3、10ppm FeSO4 0.1mL/L、pH=607~7.0[2]。

2.3 菌种的检验

接下来进行的步骤就是对纯菌落中的细菌进行检验，确定巨大芽孢杆菌。进行该步骤在目前比较先进的方法是多重PCR技术检测。其基本方法是挑取培养基上单个菌落, 接种于营养肉汤液体，30℃快速振摇培养16h，, 离心取沉淀, 采用硅藻土吸附法快速提取各菌株的基因组DNA, 作为 PCR 的模板[3]。然后对所获取的DNA利用PCR（聚合酶链式反应）进行扩增，获取足够量的DNA，以便进行测序。测序工作可送到专门服务公司进行，如海生工生物工程技术服务有限公司。

若要对菌种的形状加以改良，提高效率或增强环境适应能力等，可通过诱变育种、杂交育种、基因工程育种或人工选择等方法进行，如通过基因工程育种获得了能够生产胰岛素的菌种，利用射线照射、太空失重育种等。由于本文未涉及菌种改良就不详细叙述菌种改良这一方面的内容。

3 发酵环节的控制

发酵控制贯穿了整个发酵过程，由于发酵过程受到诸多因素（如:发酵菌体本身的遗传特性、物质运输、能量平衡、工程因素、环境因素等）交叉影响，发酵过程的控制具有不确定性和复杂性。要想很好的对其进行控制以达到充分发挥菌种生产潜力的目的，就需要全面了解菌种本身的代谢特点（如生长速率、呼吸强度、营养要求（酶系统）、代谢速率)菌代谢与环境的相关性（如温度、pH、渗透压、离子强度、溶氧浓度、剪切力等），对各参数进行调节。[24]

发酵控制的参数分为物理参数、化学参数和生物参数三种。其中物理参数包括温度、搅拌转速、空气压力、空气流量、溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳）浓度等；化学参数包括基质浓度（包括糖、氮、磷）、pH、产物浓度、核酸量等；生物参数包括菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、基质消耗速率、关键酶活力等。在二步发酵法生产维生素C过程中需要控制的参数有温度、溶解氧、菌浓度、发酵液浓度、产物浓度、pH、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等。

对这些参数进行控制的前提是测出这些量，针对其实际大小和理论大小的差异采取有效措施进行控制。针对工业中发酵生产维生素C主要是采用传感器实时测定并将信号传输到计算机中予以分析显示，制导控制。

下面就详细叙述二步发酵法生产维生素C过程中的一些控制。

3.1 伴生菌的控制

研究发现蜡状芽孢杆菌等伴生菌对氧化葡糖杆菌发酵将2-酮-L-古洛糖酸转变成维生素C具有很好的促进作用（如在协助氧化葡糖杆菌克服酸性条件，提高氧化葡糖杆菌发酵能力等方面效果明显），故而在发酵过程中可采取添加优秀的伴生菌并创造是一起生长繁殖的条件可有效提高发酵效率。[7-8，10,12] 3.2 添加成分对发酵的影响

在维生素C的发酵过程中的、添加成分分为两类，即用于发酵的原料成分和对发酵进行调节的非原料成分。前者主要是供发酵利用或供给发酵菌生长繁殖所利用，后者则主要是其调节作用，提高发酵效