杂交瘤技术的实验原理

酶联免疫吸附法(ELISA) 酶联免疫吸附法(ELISA)
技术原理： 技术原理：
有色产物 底物 第2抗体 第1抗体 待检杂交瘤培养上清液 抗原 酶标仪检测
酶
四、克隆化
常用克隆化方法： 常用克隆化方法：
有限稀释法 软琼脂平板法 显微操作法 ELISA法检测单克隆杂交瘤细胞的培养上清 ELISA 法检测单克隆杂交瘤细胞的培养上清 ， 法检测单克隆杂交瘤细胞的培养上清， 选出分泌特异性抗体的阳性孔， 选出分泌特异性抗体的阳性孔 ， 所分泌抗体即为 单克隆抗体。 单克隆抗体。
支持物
亲 合 层 析 原 理 图 解
被分离物的抗体 被分离物质
其它物质
80个细胞/96孔 80个细胞 孔 个细胞/96 饲养细胞(feeder 饲养细胞(feeder cells)
单克隆抗体(monoclonal antibody, MAb)
由单一克隆的杂交瘤细胞分泌的抗体， 由单一克隆的杂交瘤细胞分泌的抗体，只针对 于一个抗原决定簇—— 单克隆抗体 于一个抗原决定簇 ——单克隆抗体 (monoclonal 单克隆抗体(monoclonal antibody, MAb) 单克隆抗体优点： 单克隆抗体优点： 应用： 应用： 疾病的论断和治疗(生物导弹) 生物导弹) 生物大分子的鉴定、 生物大分子的鉴定、定位和分离纯化 细胞器的鉴定、 细胞器的鉴定、定位和分离 特定细胞或病毒的鉴定、 特定细胞或病毒的鉴定、定位和分离
分泌抗体 短命 脾细胞 (B淋巴细胞) (B淋巴细胞 淋巴细胞) 长命 不分泌抗体 骨髓瘤细胞
分泌抗体 长命 杂交瘤细胞
Köhler和 Köhler和Milstein, 1975
1984年 Nobel医学奖 1984 年 Nobel 医学奖
3. 杂交瘤细胞的筛选 ：
脾细胞 (B淋巴细胞) (B淋巴细胞 淋巴细胞)
二、杂交瘤技术的操作流程 1. 动物免疫： 动物免疫：
特定目标抗原 特定目标抗原
免疫 目的： 目的： 在细胞融合后获 得尽可能多的分 泌针对于该目标 抗原的特异性抗 体的杂交瘤细胞. 体的杂交瘤细胞.
动物
刺激
脾脏中B 脾脏中B淋巴细胞 B淋巴细胞大量增殖 淋巴细胞大量增殖
能分泌针对于该抗 原的特异性抗体 原的特异性抗体
H
次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ( HGPRT )
外源性途径(旁路途径) 外源性途径(旁路途径)
谷氨酰胺 or 单磷酸尿苷酸
二氢叶酸还原酶
A
内源性途径(主要途径) 内源性途径(主要途径)
外源性途径(旁路途径) 外源性途径(旁路途径)
DNA
T
胸腺嘧啶激酶 ( TK ) (Thymidine kinase) B淋巴细胞： HGPRT+， TK+ 淋巴细胞： 骨髓瘤细胞： 骨髓瘤细胞： HGPRT-， TK存活 死亡
杂交瘤技术制备单克隆 抗体的实验原理
一、杂交瘤技术产生的3 一、杂交瘤技术产生的3个技术关键
1. B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性： B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性 淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性：
B淋巴细胞(B lymphocytes)： 淋巴细胞(B lymphocytes)： 接受抗原刺激后， 分泌针对该抗原的 接受抗原刺激后 ， 能 分泌 针对该抗原的 特异性 针对该抗原的特异性 抗体，在体液免疫中具有重要功能。 抗体，在体液免疫中具有重要功能。 终末分化细胞， B淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再 淋巴细胞本身是一种终末分化细胞 进行细胞分裂， 存活一段时间后便会死亡—— 短命 进行细胞分裂 ， 存活一段时间后便会死亡 ——短命 细胞
2、HAT培养基的筛选 HAT培养基的筛选
融合后细胞混合液 HAT培养基 HAT培养基
2 weeks later
HT培养基 HT培养基
1 week later
正常培养基
三、抗体的检测
要求： 要求：
常用方法： 常用方法：
简便、快速、敏感; 简便、快速、敏感; 在短时间内能检测大量样品
酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) (enzyme间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence, IFA) 放射免疫法(radioimmunoassay, RIA) 双相扩散法
骨髓瘤细胞
杂交瘤细胞
脾细胞/ 脾细胞/×脾细胞
骨髓瘤细胞/ 骨髓瘤细胞/ ×骨髓瘤细胞
脾细胞
骨髓瘤细胞
筛选出
不能长期存活
不能长期存活
HAT培养基筛选 HAT培养基筛选
H, 次黄嘌呤 A, 氨基喋呤 T, 胸腺嘧啶 次黄嘌呤; 氨基喋呤;
(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase) hosphor
常用免疫方法： 常用免疫方法：
☺常规免疫法 ☺短程免疫法 ☺体外免疫法
“稳妥；优势克隆” 稳妥；优势克隆” “省时；省抗原” 省时；省抗原”
☺脾内一次性免疫法
“省时” 省时” “操作繁琐” 操作繁琐”
免疫途径： 皮下注射 免疫途径： 腹腔注射 静脉注射
常规免疫法： 常规免疫法：
第1次免疫：抗原+福氏完全佐剂 (皮下注射) 次免疫：抗原+ 皮下注射) 第2次免疫：抗原+福氏不完全佐剂 (皮下注射) 次免疫：抗原+ 皮下注射) 第3次免疫：抗原+不加佐剂 (皮下注射或静脉注射) 次免疫：抗原+ 皮下注射或静脉注射) 第4次免疫：抗原+不加佐剂 (静脉注射) 次免疫：抗原+ 静脉注射)
骨髓瘤细胞 (myeloma cells):
恶性增殖的转化细胞， 恶性增殖的转化细胞， 只要营养条件适合可 永远分裂和存活——长命细胞 永远分裂和存活——长命细胞。 长命细胞。 经筛选与驯化， 经筛选与驯化 ， 现已建立多种骨髓瘤细胞 株——没有抗体分泌物。 ——没有抗体分泌物 没有抗体分泌物。
2. 细胞融合技术： 细胞融合技术：
Biblioteka Baidu
二、细胞融合及HAT筛选 细胞融合及HAT筛选
1、细胞融合方法： 细胞融合方法：
病毒介导的细胞融合 PEG介导细胞融合 PEG介导细胞融合 电激融合
细胞悬液的制备与融合
(1) 脾细胞悬液的制备：最后一次免疫后第3天制备 脾细胞悬液的制备：最后一次免疫后第3 (2) 骨髓瘤细胞悬液的制备：于对数生长期制备 骨髓瘤细胞悬液的制备： (3) 细胞融合：50%PEG(1000~4000), pH8.0, 38oC, 1min 细胞融合：50%PEG(1000~4000),
• 高度纯一 • 高度专一
五、大规模培养——批量生产单克隆抗体 ——批量生产单克隆抗体
常用的大规模培养方法： 常用的大规模培养方法：
动物接种法 转瓶培养法 细胞培养罐法
动物免疫 BALB/c
X抗原
B淋巴细胞 瘤的突变株 培养上清中X 培养上清中X抗体的检测 克隆化培养
分泌X 分泌X抗体 B淋巴细胞 培养数天后细胞死亡
骨髓瘤细胞 无限生长细胞 单克隆杂交瘤细胞培养上清中X 单克隆杂交瘤细胞培养上清中X抗体的检测
细胞融合 混合细胞的HAT筛选) HAT筛选 混合细胞的HAT筛选) 杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体
只有杂交瘤细胞可长期存活下来 分泌 X抗体
规模化培养 获得大量单克隆抗体
杂交瘤技术操作流程图解
抗体纯化
洗脱液