第二章工业发酵菌种选育

乳酸杆菌
葡萄球菌
2、放线菌
细胞结构介于细菌和真菌之间。菌丝组成一个 菌丝体，单细胞的个体，没有成形的细胞核。无 性孢子进行繁殖。

60%以上的抗生素由放线菌生成。 链霉素、土霉素、金霉素、卡那霉素、庆大霉 素、庆丰霉素、井岗霉素等等。

种类：龟裂链霉菌、金霉素链霉菌、灰色链霉 菌、红霉素链霉菌

1 、从自然界分离筛选 2 、从菌种保藏机构获得

3、从生产过程中已有的菌种中筛选发 生正突变的优良菌种
第二节 生产菌种的选育
方法 自然选育； 诱变育种； 杂交育种； 基因工程育种；

一、自然选育

以从自然界筛选菌种为例，筛选步骤：
1、样品的采集 2、目的菌的富集培养 4、菌种的初筛 5、菌种的复筛 6、菌种发酵性能的鉴定 7、菌种的保藏

4

抑菌圈法
常用于抗生素产生菌的分离筛选。 工具菌：抗生素的敏感菌。 若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物 质，如抗生素等，便会在该菌落周围形 成工具菌不能生长的抑菌圈，很容易被 鉴别出来。

滕黄八叠球菌
洁霉菌
抗生素筛选
降解 纤维 素产 生产 透明 圈
•
摇 床 复 筛
•
初筛可以变色圈或透明圈 的大小来挑取参加复筛者， 而将90%的菌落淘汰。 在数量减少后就要仔细比 较参加复筛和再复筛的菌 株，最后才能选得优秀菌 株。在以后的复筛阶段， 还应不断结合自然分离， 纯化菌株。
2
变色圈法
用刚果红染色法鉴定筛选降解纤维素的菌株
羧甲基纤维素钠作培养物
3.生长圈法

将待检菌涂布于含高浓度的工具菌（营养 缺陷型）并缺少所需营养物的平板上进行 培养，若某菌株能合成平板所需的营养 物，在该菌株的菌落周围便会形成一个混 浊的生长圈。
如嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤 的琼脂混合倒平板，在其上涂布含菌样 品保温培养，周围出现生长圈的菌落即 为嘌呤产生菌。 筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生 菌。
诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂
诱变剂
{
物理在：紫外，快中子 化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍
（二）、诱变剂处理过程中几个有关的问题
化学诱变剂使用过程的安全性 诱变剂量的选择 诱变剂的选择 出发菌株的选择
压硝酸：0.07MNa2HPO4 亚硝基胍：1MNaOH
诱变育种方案设计
A. 诱发突变 常用诱发剂及其特点 诱变剂的选择 不稳定菌株－－－－温和诱变剂 稳定菌株－－－－强烈的、广谱的诱 变剂 低剂量诱变剂有利于高产菌株的稳定 性
第二章 工业发酵菌种选育及种子扩大培养
重点：生产用菌种的保藏及选育；防止菌种
衰退的措施种子扩大培养。
难点：种子扩大培养；掌握种子制备的原理
与技术及影响种子质量的因素。 重点掌握种子质量的控制措施。 了解种子制备的放大原理与技术

能力目标
1、 能利用自然选育技术对生产菌种进 行纯种分离或复壮。 2 、能利用诱变育种技术对生产菌种进 行紫外诱变或化学诱变的选育。 3、能对生产菌种进行合理保藏。 4、能对生产用的种子进行扩大培养。

例如，分离柠檬酸产生菌的黑曲霉 pH2.0～2.5，
调节
2）控制温度、压力渗透压、溶解氧浓度 等条件进行富集培养。 3）添加一些专一性的抑制剂，可提高分 离效率； 例如： 在分离放线菌时，可先在土壤样品悬液 中加10％的酚液数滴，以抑制霉菌和细 菌的生长。


在分离除链霉菌以外的放线菌时，先将土样 在空气中干燥，再加热到100℃保温1h，可减 少细菌和链霉菌的数量。 分离耐高浓度酒精和高渗酵母菌时，可分别 将在高浓度酒精和高浓度蔗糖溶液中处理一 段时间，杀死非目的微生物后再进行分离。
二、工业常用的微生物
细菌： 放线菌： 酵母菌： 丝状真菌，霉菌
1、细菌

醋酸杆菌: 可将酒精 → 醋酸； 乳酸杆菌: 将糖 → 乳酸。用于食品工业的酸味 剂、防腐剂、还原剂、制革辅料等。 枯草芽胞杆菌：麦麸皮、玉米粉、豆饼粉等→ α－淀粉酶。 重组大肠杆菌：生产胰岛素、生长激素。



大肠杆菌
4. 5.
6.
I. 1)
突变株的筛选（Selection） 随机筛选 (Random selection) 摇瓶筛选法
初筛一般是一个菌株只做一个摇瓶，从大 量菌株中选出10-20%较好的菌株，淘汰8090%的菌株；而复筛中摇瓶培养一般是一个菌 株培养3瓶，选出3-5个较好的菌株，再做进一 步比较，选出最佳的菌株。
诱变剂的选择

野生型菌株(遗传性不稳定):用缓和的 诱变剂。 遗传性稳定的菌株 : 先要用强烈的不常 用的诱变谱广的诱变剂处理，使其发生 强烈的变异，然后再用缓和的诱变剂进 行处理或多次自然分离。
2.
3.
要考虑诱变剂的作用机理来选择诱 变剂，两种诱变剂复合使用效果 好。
最适剂量(有2种观点)： 1.杀菌率90%－99%较好，甚至 99.9%; 2.杀菌率75%－85%。

放线菌
放线菌菌落形态
3、酵母菌
真核微生物
（1）酿酒酵母 除了酿酒，还能从中提取出核
酸、维生素C、辅酶A。 （2）产朊假丝酵母
料用的单细胞蛋白。
用于生产食用、药用和饲
酵 母 菌
4、霉菌
真核微生物 （1）米曲霉:α－淀粉酶活性强，糖化酶 活性弱。 （2）黑曲霉: 用于生产酸性蛋白酶、酒 精、有机酸（柠檬酸、乳酸、衣康酸）。 植物生长激素（赤霉素）、杀是农药（白 僵菌剂）。其变异株可以产生柠檬酸、葡 萄糖酸、草酸等、糖化酶 （3）青霉
masS/(KS+S)‫‏‬



KS——饱和常数。 微生物生长中，生长培养基中只有一种 物质的浓度会影响其生长速率。
百度文库
这种基质称为限制性基质

4. 纯种的分离
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于 微生物的混杂生长状态。因此还必须分离， 纯化。
1、平板划线分离法 2、稀释分离法

基本原则：
确保培养出单个菌落。


曲霉属
霉菌
应用：生产有机酸、生产淀粉酶、果胶 酶、葡萄糖氧化酶

应用：酱油、酱类（淀粉酶）

米曲霉 应用：产糖化酶和蛋白酶、主要用于酿酒 制曲和酱油制曲
青 霉 菌
青霉菌

曲霉
黑曲霉
红曲霉

根霉


根霉
种类：米根霉、华根霉、少根根霉、爪哇根霉 应用：酿酒
三、工业发酵生产菌种来源

第一节
工业发酵菌种 工业发酵菌种选育 菌种的保藏 种子扩大培养
第二节
第三节
第四节
第一节 工业发酵菌种 一、工业对菌种的要求
发展趋势： 从野生型 自然选育 诱变育种 变异株 代谢控制育种 基因工程定向育种
一、工业对菌种的要求
1、培养基原料来源广、廉价，且生成的目
的产物的产量高； 2、生长较快，发酵周期短； 3、培养条件易控制； 4、抗噬菌体及杂菌能力强； 5、菌株不易变异退化； 6、对设备放大的适应性强； 7、菌体本身不能是病原菌；

碳源和氮源



例如： 筛选纤维素酶产生菌时，以纤维素作为唯 一碳源； 筛选脂肪酶产生菌时，以植物油作为唯一 碳源。
用含有酪蛋白为有机氮源的平板培养基，可 以鉴别蛋白酶的产生菌。

B、控制培养条件


1）控制培养基的pH值，有利于排除不需 要的、对酸碱敏感的微生物； 细菌、放线菌的生长繁殖对pH一般要求 偏碱，霉菌和酵母菌要求偏酸。
3、富集培养

富集培养（增值培养）
目的：即设法增加所要菌种的数量(优势 种），以增加分离的几率。 定义：给混合菌群提供一些有利于所需 菌株生长或不利于其它菌型生长的条 件，以促使目标菌株大量繁殖，从而有 利于分离。



两类方法进行富集： A、控制培养基营养成分 B、控制培养条件

A、控制培养基营养成分
2.平皿划线分离法 A 分区划线分离法
B 连续划线分离法
2、稀释分离法
2、稀释分离法
把土壤样品以十倍的级差进 行稀释，取一定量的某一稀释 度的悬浮液，涂抹于分离培养 基的平板上，经过培养，长出 单个菌落。

5 菌种的初筛和复筛

初筛--目的是除去大部份（80～90 ％）明确不符合要求的菌株，尽量保 留优良菌株；以量为主，精确为次； 尽可能简单、快速和经济。
1、平板划线分离法
平板划线分离法
菌种制备成单孢子或单细胞悬浮液，经过适当 的稀释后，在固体培养基表面作有规则的划线 菌样经过多次从点到线的稀释，最后经培养得 到单菌落。 划线法是将含菌样品在固体培养基表面作有规 则的划线(有扇形划线法、方格划线法及平行 划线法等)，菌样经过多次从点到线的稀释， 最后经培养得到单菌落。 该分离方法操作简便、快捷，效果较好。

1.透明圈法

在分离水解酶产生菌时采用较多，
如 脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶 产生菌。 在平板培养基中加入溶解性较差的底 物，使培养基混浊。能分解底物的微生 物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大 小初步反应该菌株利用底物的能力。

在分离产生有机酸的菌株时

在选择性培养基中加入碳酸钙，使平板 成混状，将样品悬浮液涂抹到平板上进 行培养，由于产生菌能够把菌落周围的 碳酸钙水解，形成清晰的透明圈。
复杂、耗时
诱变育种

诱变育种的一般步骤以合适的诱变剂(物理及 化学诱变剂)处理大量而均匀分散的细胞悬液 (单细胞或单孢子),在引起绝大多数细胞死亡的 同时,使存活个体中碱基变异频率大幅度提高. ★用合适的方法将极少数性能优良的正突变株 筛选出来.

第三节 菌种的保藏
一、菌种保藏原理
1、目的： ①存活，不丢失，不污染； ②防止优良性状丢失； ③随时为生产、科研提供优良菌种。 2、基本原理： 通过保持 缺营养，缺氧，干燥和低温， 使 菌种处于“休眠状态”，抑制其繁殖能力。
物理诱变剂
紫外线、X-射线、 γ-射线、 快中子
特点：紫外线方便、有效、使用安 全，其他的几种射线有一定的穿透力
化学诱变剂
碱基类似物、吖啶类、烷化剂 特点：高效、经济、但应注意使用安
全
出发菌株的选择
1. 选择纯种 2. 平均发酵单位要高，且发酵单位的波动幅 度不同，摇瓶间所测得结果的最高值和最低值 之差要小。 3. 有良好的代谢特性 4. 选择对诱变剂敏感的菌株。 5. 选用多个出发菌株进行诱变收效较较快。
二、诱变育种
突变：由于染色体或基因本身的变化而产生 遗传性状的变异。 表型迟延：表型改变落后于基因型改变的现 象。
（一）、诱变剂的作用原理
各种诱变的机制
1.诱变育种的主要环节
紫外线
选择优良突变株
接种
出发菌株
含诱变剂的液体培养基
接种分离
用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变 进行的筛选，称为诱变育种
1、样品的采集
以采集土壤为主。 中性偏碱的土壤以细菌和放线菌为主； 酸性红土壤及森林土壤中霉菌较多； 果园、菜园等富含碳水化合物的土壤酵 母和霉菌较多。


5-25cm土层

样品的采集


将采集到的土样盛入清洁的聚乙烯袋、牛皮袋 或玻璃瓶中。 采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日 期、地点以及采集地点的地理、生态参数等。 采好的样品应及时处理，暂不能处理的也应贮 存于4℃下，但贮存时间不宜过长。



富集培养方式

分批培养：选择移种时间，所需菌种占 优势的情况下移种。 连续培养：比生长速率与限制性基质的 浓度关系。 半连续培养：



恒化器培养
• 富集所需菌种也可 以用恒化器培养混 合菌群的方法进 行。


比生长速率:单位菌体在单位时间内生长 所增加菌体的量. 莫诺德Monod
μ =μ

初筛常用
平皿快速筛选法
利用平皿的生化反应进行分离

利用特殊的分离培养基对大量混杂微生 物进行初步分离的方法。

常用的平皿显色法
1、 透明圈法： 混浊底物被分解后形成透明圈。如可 溶性淀粉、碳酸钙等。 2、 变色圈法：直接用显色剂或指示 剂。 3、 生长圈法： 4 、 抑菌圈法
复筛

复目的是确认符合生产要求的菌株。 以质为主，应该精确测定每一个菌株的 生产指标。一般在摇瓶、小型发酵罐上 进行。
筛选： 将分离培养后的各型单菌落接
斜面培养，成熟后接入摇瓶，测定其 发酵生产能力的过程。


初筛：以迅速筛出大量的达到初步要 求的分离菌落为目的，以量为主。 复筛：则是精选，以质为主，也就是 以精确度为主。


举例：

分离厌氧菌时，可加入少量硫乙醇酸钠作为还原 剂，有利于厌氧菌的生长繁殖。
筛选霉菌时，可在培养基中加入四环素等抗生素抑 制细菌。 分离放线菌时，在样品悬浮液中加入10滴10%的苯 酚或加青霉素（抑制G+菌）、链霉素（抑制G-菌） 各30～50U/ml，以及丙酸钠10μ g/ml（抑制霉菌 类）抑制霉菌和细菌的生长。