生物样品中脱氢表雄酮检测方法的研究进展_陈崝
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APCI 在弱极性和非极性物质检 测 中 表 现 的 很 优 秀。Ren 等［10］使用 HPLC － APCI － MS 检测小鼠脑组织中的脱氢表雄酮， 用 2 － 硝基 － 4 － 三氟甲基苯肼 （ 2 － NTPH） 进行衍生，线性范 围为 0. 030 ～ 2. 00 mg / L。但是 APCI 离子化需要较高的流速， 对于保留时间接近的物质，不容易完整地分离，在使用 APCI 进行检测时，往往需要进行完整的抗干扰试验［11］。
2 荧光光度法
甾体类激素本身不具备荧光或荧光强度很低，因而需要对 被检物 进 行 衍 生，如 氟 硼 二 吡 咯 荧 光 素 等。Chen 等［2］ 使 用 1，2 － 苯并 － 3，4 － 二氢咔唑 － 9 － 乙氧基甲酰肼（ BECE） 衍生小
鼠粪便中的甾体激素，发现最大激发波长为 333 nm，最大发射 波长为 390 nm。
第 41 卷第 9 期 2013 年 5 月
广州化工 Guangzhou Chemical Industry
Vol. 41 No. 9 May. 2013
生物样品中脱氢表雄酮检测方法的研究进展
陈崝
( 东南大学学习科学研究中心，江苏 南京 210096)
摘 要： 脱氢表雄酮及其代谢产物脱氢表雄酮硫酸酯是人体重要的甾体激素，准确定量检测人体生物基质中的含量对临床
生理、心理疾病的诊断具有重要意义。本文介绍了近几年国内外先进的检测技术，并分析了各个方法的优缺点，指出气相色谱 － 质谱法适合检测物含量低的生物样品检测，而液相色谱 － 质谱法的应用范围最广。
关键词： 生物样品； 脱氢表雄酮； 脱氢表雄酮硫酸酯； 检测方法
中图分类号： O657
文献标识码： A
文章编号： 1001 － 9677（ 2013） 09 － 0048 － 03
Abstract： Dehydroepiandrosterone and its sulfate were important steroids. The accurate determination of these steroids would be potentially useful for the diagnosis of clinical pathological syndromes and psychological status. Some novel assay methods were summarized and their advantages and disadvantages were analyzed. Gas chromatography － mass spectrometry was suitable for biological samples with low steroids contents and the detect application of liquid chromatography － mass spectrometry was the widest.
陈君等［8］则使用七氟丁酸酐 （ HFBA） 衍生大鼠血清中的 DHEA，线性范围在 0. 1 ～ 100 μg / L，相关系数 r 为 0. 9996，加 标回收率在 99% ～ 106% 之间。
5 液相色谱 － 质谱法
液相色谱 － 质谱法 （ LC － MS） 是目前检测甾体类激素常 用的方法，该方法灵敏度高、特异性好，因而得到广泛应用。
第 41 卷第 9 期
陈崝： 生物样品中脱氢表雄酮检测方法的研究进展
49
N － 三甲基硅烷基 － 三氟乙酰胺 （ MSTFA） 是另一种衍生 剂。Bayle 等［6］ 使 用 1000 /4 /2 （ V / m / m ） 的 MSTFA / NH4 I / DTE （ dithioerythritol） 混合溶液衍生经过处理的女性尿液样品。方法 检测 限 为 10 ng / mL，定 量 限 为 20 ng / mL，精 密 度 在 83% ～ 91% 之间。沈敏等［7］使用 1000 /5 /5 （ V / V / m） 的 MSTFA / TMIS （ iodotrimethylsilane） / DTE 衍生头发中内源性脱氢表雄酮，检出 限为 0. 2 pg / mg，线性范围为 0. 5 ～ 200 pg / mg，加标回收率在 90. 1% ～ 97. 2% 之间，日内日间变异在 5. 8% ～ 16. 5% 之间。
参考文献
［1］ A． GERGELY，Gy． SZASZ，A． SZENTESI，et al． Evaluation of CD detection in an HPLC system for analysis of DHEA and related steroids ［J］． Analytical and bioanalytical chemistry，2006，384 （ 7） ： 1506 － 1510．
离子化源是 LC － MS 系统中的关键元件，关系到方法的检 测范围、灵敏度、特异性等。常用的离子化源有大气压光学电 离离子化源 （ APPI） 、大气压化学电离离子化源 （ APCI） 和电 喷雾离子化源 （ ESI） 三种。
APPI 出现的较晚，技术较新。Guo 等［9］使用 APPI 检测血 清中 12 种甾体激素，该方法用乙腈除去血清中蛋白后，用水 稀释，将稀释液直接进样。其中脱氢表雄酮和脱氢表雄酮硫酸 酯的检测 限 分 别 为 10 pg / mL 和 2 pg / mL； 回 收 率 为 92% 和 91. 8% ； 日内日间变异均小于 11. 9% 。
Research Development of Determination Method of Dehydroepiandrosterone in Biological Samples
CHEN Zheng （ Research Center of Learning Science，Southeast University，Jiangsu Nanjing 210096，China）
4 气相色谱 － 质谱法
气相色谱 － 质谱法 （ GC － MS） 是一种较早运用于生物样 品中甾体类激素检测的方法，其灵敏度和特异性都很好。大部 分甾体激素热稳定性较好，挥发性较差，使用 GC 法需要很高 的温度，因而需要预先衍生。
Hill 等［5］使用 N，O － 二 （ 三 甲 基 硅 烷 基 ） － 三 氟 乙 酰 胺 （ BSTFA） 进行衍生，检测血清中脱氢表雄酮的含量。90 ℃ 下使 用 BSTFA 衍生处理好的血清样品 1 h，氮气吹干后用 20 μL 异 辛烷溶解进样。方法检测限为 2. 2 pmol / L，日内日间变异小于 5. 5% 。
目前使用 GC － MS 法检测生物样品中多种甾体激素的方法
已经较为成熟，方法的灵敏度极高，检测限极低，适用于诸如 头发等脱氢表雄酮含量极低的生物样品的分析。然而该方法通 常需要衍生及多步萃取过程，样品处理过程较为繁琐，费时费 力。
LC － MS 法也具备较好的分离效果和较高的灵敏度，适用 于多种甾体的同时检测。在多甾体类激素检测中，仅有 Guo 等 的研究通过使用 APPI，做到了同时检测生物样品中极性和非极 性甾体激素； 大部分使用 APCI 作为离子化源的研究均只能对 非极性或 弱 极 性 甾 体 激 素 进 行 同 时 检 测。而 相 较 于 APPI 及 APCI 两种离子化源，ESI 表现出更广的检测范围，对极性物质 的灵敏度高于 APCI； 对弱极性和非极性物质，可以通过衍生等 方法改变 物 质 极 性 以 达 到 更 好 的 灵 敏 度。 因 此， 在 多 物 质 检 测，尤其是极性不同的物质的同时检测中，ESI 能体现出更好 的适应性。
ESI 的检测范围较 APCI 更广，适合极性分子和大分子物质 的检测。Higashi 等［12］使用 ESI 检测唾液中的脱氢表雄酮硫酸 酯，检测限可至 0. 1 ng / mL。对于非极性或弱极性物质，可以 通过衍生等方法改善被测物极性以增加信号相应。Regal 等［13］ 利用羟胺 90 ℃ 衍生脱氢表雄酮 30 min，使 17 位碳原子上的酮 基羟胺化。衍生后，脱氢表雄酮的检测限为 15 ng / dL，定量限 为 25 ng / dL，日 内 变、日 间 变 异 小 于 10% ，加 标 回 收 率 为 105. 3% 。Shibayama 等［14］使用 2 － 肼基 － 1 － 甲基吡啶 （ HMP） 衍生脱氢表雄酮，定量限为 20 ng / mL，加标回收率为 89. 9% ± 2. 3% ，日内、日间变异小于 1. 4% 。
3 免疫法
免疫法 又 分 为 酶 免 疫 分 析 法 （ EIA） 、放 射 免 疫 分 析 法 （ RIA） 、化学发光免疫分析法 （ CLEIA） 和电致化学发光免疫 分析法 （ ECLIA） 等，都具有极高的灵敏度和便利性。
在 Kurita 等［3］的实验中，分别用 RIA 法检测血液脱氢表雄 酮，CLEIA 法 检 测 血 液 脱 氢 表 雄 酮 硫 酸 酯，检 测 限 分 别 为 0. 064 ng / mL 和 11 ng / mL，两 者 的 日 内 和 日 间 变 异 分 均 小 于 10. 6% 。Kazihnitkova 等［4］设计了一种 RIA 法检测 7 － O － DHEA 的方法，方法检测限为 0. 06 pmol / 管，日内日间差异为 4. 1% 和 8. 3% ，加标回收率为 78. 8% ～ 112% 之间。
6结论
紫外 － 可见光分光光度法和荧光分光光度法的灵敏度不够 高，不能准确定量生物样品中的痕量脱氢表雄酮。
免疫法的灵敏度很高临床检测中应用较多。然 而免疫法的特异性往往较差，存在交叉反应的影响。Kazihnitkova 等［15］用 RIA 法检测小鼠脑组织中脱氢表雄酮时发现，脱氢 表雄酮与脱氢表雄酮硫酸酯的交叉反应为 106% ，日内、日间 变异在 14. 5% ～ 25. 3% 之间。由于抗体设计不同等因素，会造 成不同免疫 法 的 检 测 结 果 存 在 差 异，因 此 在 检 测 同 一 批 样 品 时，尽量选用 同 一 型 号 同 一 批 次 制 备 的 抗 体， 以 减 少 批 间 效 应。
Key words： biological samples； dehydroepiandrosterone； dehydroepiandrosterone sulfate； determination method
脱氢表雄酮 （ DHEA） 是人体含量极为丰富的激素之一， 与人体的健康息息相关。人体内脱氢表雄酮和脱氢表雄酮硫酸 酯可以互相转换，脱氢表雄酮多以硫酸酯的形式在体内循环。 脱氢表雄酮及硫酸酯具有一些生理作用，比如神经保护、促进 神经元再生、抑制细胞毒性和抗糖皮质激素作用等，与肥胖、 糖尿病、动脉粥样硬化、抑制癌症发生、治疗阿尔兹海默病等 有关。研究还发现，脱氢表雄酮及硫酸酯与长期应激、焦虑、 抑郁、自闭症等有关。
准确检测生物样品中脱氢表雄酮和脱氢表雄酮硫酸酯在生 理疾病和心理状态的诊断都具有重要意义。
1 紫外 － 可见光分光光度法
由于甾体环和一些酮羰基的存在，甾体激素都具备一定的 紫外吸光度。
Gergely 等［1］使用反相离子对高效液相色谱 － 圆二色光谱仪 在 295 nm 处检测脱氢表雄酮及硫酸酯，该方法使用含 20 mM 硫酸铵的甲醇 （ 30% ～ 100% ） 作为流动相，四丁铵阳离子配 对交换，线性范围为 0. 5 ～ 2 mg / mL，加标回收率在 99. 1% ～ 100. 8% 之间，日内日间精密度均大于 98% 。
［2］ W． CHEN，H． ZHANG，Q． GUO，et al． Determination of Steroids from Rat Feces by High Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Derivatization and Identification by On － line Mass Spectrometry［J］． Chinese Journal of Analytical Chemistry，2006，34 （ 10 ） ： 1406 － 1412．
2 荧光光度法
甾体类激素本身不具备荧光或荧光强度很低，因而需要对 被检物 进 行 衍 生，如 氟 硼 二 吡 咯 荧 光 素 等。Chen 等［2］ 使 用 1，2 － 苯并 － 3，4 － 二氢咔唑 － 9 － 乙氧基甲酰肼（ BECE） 衍生小
鼠粪便中的甾体激素，发现最大激发波长为 333 nm，最大发射 波长为 390 nm。
第 41 卷第 9 期 2013 年 5 月
广州化工 Guangzhou Chemical Industry
Vol. 41 No. 9 May. 2013
生物样品中脱氢表雄酮检测方法的研究进展
陈崝
( 东南大学学习科学研究中心，江苏 南京 210096)
摘 要： 脱氢表雄酮及其代谢产物脱氢表雄酮硫酸酯是人体重要的甾体激素，准确定量检测人体生物基质中的含量对临床
生理、心理疾病的诊断具有重要意义。本文介绍了近几年国内外先进的检测技术，并分析了各个方法的优缺点，指出气相色谱 － 质谱法适合检测物含量低的生物样品检测，而液相色谱 － 质谱法的应用范围最广。
关键词： 生物样品； 脱氢表雄酮； 脱氢表雄酮硫酸酯； 检测方法
中图分类号： O657
文献标识码： A
文章编号： 1001 － 9677（ 2013） 09 － 0048 － 03
Abstract： Dehydroepiandrosterone and its sulfate were important steroids. The accurate determination of these steroids would be potentially useful for the diagnosis of clinical pathological syndromes and psychological status. Some novel assay methods were summarized and their advantages and disadvantages were analyzed. Gas chromatography － mass spectrometry was suitable for biological samples with low steroids contents and the detect application of liquid chromatography － mass spectrometry was the widest.
陈君等［8］则使用七氟丁酸酐 （ HFBA） 衍生大鼠血清中的 DHEA，线性范围在 0. 1 ～ 100 μg / L，相关系数 r 为 0. 9996，加 标回收率在 99% ～ 106% 之间。
5 液相色谱 － 质谱法
液相色谱 － 质谱法 （ LC － MS） 是目前检测甾体类激素常 用的方法，该方法灵敏度高、特异性好，因而得到广泛应用。
第 41 卷第 9 期
陈崝： 生物样品中脱氢表雄酮检测方法的研究进展
49
N － 三甲基硅烷基 － 三氟乙酰胺 （ MSTFA） 是另一种衍生 剂。Bayle 等［6］ 使 用 1000 /4 /2 （ V / m / m ） 的 MSTFA / NH4 I / DTE （ dithioerythritol） 混合溶液衍生经过处理的女性尿液样品。方法 检测 限 为 10 ng / mL，定 量 限 为 20 ng / mL，精 密 度 在 83% ～ 91% 之间。沈敏等［7］使用 1000 /5 /5 （ V / V / m） 的 MSTFA / TMIS （ iodotrimethylsilane） / DTE 衍生头发中内源性脱氢表雄酮，检出 限为 0. 2 pg / mg，线性范围为 0. 5 ～ 200 pg / mg，加标回收率在 90. 1% ～ 97. 2% 之间，日内日间变异在 5. 8% ～ 16. 5% 之间。
参考文献
［1］ A． GERGELY，Gy． SZASZ，A． SZENTESI，et al． Evaluation of CD detection in an HPLC system for analysis of DHEA and related steroids ［J］． Analytical and bioanalytical chemistry，2006，384 （ 7） ： 1506 － 1510．
离子化源是 LC － MS 系统中的关键元件，关系到方法的检 测范围、灵敏度、特异性等。常用的离子化源有大气压光学电 离离子化源 （ APPI） 、大气压化学电离离子化源 （ APCI） 和电 喷雾离子化源 （ ESI） 三种。
APPI 出现的较晚，技术较新。Guo 等［9］使用 APPI 检测血 清中 12 种甾体激素，该方法用乙腈除去血清中蛋白后，用水 稀释，将稀释液直接进样。其中脱氢表雄酮和脱氢表雄酮硫酸 酯的检测 限 分 别 为 10 pg / mL 和 2 pg / mL； 回 收 率 为 92% 和 91. 8% ； 日内日间变异均小于 11. 9% 。
Research Development of Determination Method of Dehydroepiandrosterone in Biological Samples
CHEN Zheng （ Research Center of Learning Science，Southeast University，Jiangsu Nanjing 210096，China）
4 气相色谱 － 质谱法
气相色谱 － 质谱法 （ GC － MS） 是一种较早运用于生物样 品中甾体类激素检测的方法，其灵敏度和特异性都很好。大部 分甾体激素热稳定性较好，挥发性较差，使用 GC 法需要很高 的温度，因而需要预先衍生。
Hill 等［5］使用 N，O － 二 （ 三 甲 基 硅 烷 基 ） － 三 氟 乙 酰 胺 （ BSTFA） 进行衍生，检测血清中脱氢表雄酮的含量。90 ℃ 下使 用 BSTFA 衍生处理好的血清样品 1 h，氮气吹干后用 20 μL 异 辛烷溶解进样。方法检测限为 2. 2 pmol / L，日内日间变异小于 5. 5% 。
目前使用 GC － MS 法检测生物样品中多种甾体激素的方法
已经较为成熟，方法的灵敏度极高，检测限极低，适用于诸如 头发等脱氢表雄酮含量极低的生物样品的分析。然而该方法通 常需要衍生及多步萃取过程，样品处理过程较为繁琐，费时费 力。
LC － MS 法也具备较好的分离效果和较高的灵敏度，适用 于多种甾体的同时检测。在多甾体类激素检测中，仅有 Guo 等 的研究通过使用 APPI，做到了同时检测生物样品中极性和非极 性甾体激素； 大部分使用 APCI 作为离子化源的研究均只能对 非极性或 弱 极 性 甾 体 激 素 进 行 同 时 检 测。而 相 较 于 APPI 及 APCI 两种离子化源，ESI 表现出更广的检测范围，对极性物质 的灵敏度高于 APCI； 对弱极性和非极性物质，可以通过衍生等 方法改变 物 质 极 性 以 达 到 更 好 的 灵 敏 度。 因 此， 在 多 物 质 检 测，尤其是极性不同的物质的同时检测中，ESI 能体现出更好 的适应性。
ESI 的检测范围较 APCI 更广，适合极性分子和大分子物质 的检测。Higashi 等［12］使用 ESI 检测唾液中的脱氢表雄酮硫酸 酯，检测限可至 0. 1 ng / mL。对于非极性或弱极性物质，可以 通过衍生等方法改善被测物极性以增加信号相应。Regal 等［13］ 利用羟胺 90 ℃ 衍生脱氢表雄酮 30 min，使 17 位碳原子上的酮 基羟胺化。衍生后，脱氢表雄酮的检测限为 15 ng / dL，定量限 为 25 ng / dL，日 内 变、日 间 变 异 小 于 10% ，加 标 回 收 率 为 105. 3% 。Shibayama 等［14］使用 2 － 肼基 － 1 － 甲基吡啶 （ HMP） 衍生脱氢表雄酮，定量限为 20 ng / mL，加标回收率为 89. 9% ± 2. 3% ，日内、日间变异小于 1. 4% 。
3 免疫法
免疫法 又 分 为 酶 免 疫 分 析 法 （ EIA） 、放 射 免 疫 分 析 法 （ RIA） 、化学发光免疫分析法 （ CLEIA） 和电致化学发光免疫 分析法 （ ECLIA） 等，都具有极高的灵敏度和便利性。
在 Kurita 等［3］的实验中，分别用 RIA 法检测血液脱氢表雄 酮，CLEIA 法 检 测 血 液 脱 氢 表 雄 酮 硫 酸 酯，检 测 限 分 别 为 0. 064 ng / mL 和 11 ng / mL，两 者 的 日 内 和 日 间 变 异 分 均 小 于 10. 6% 。Kazihnitkova 等［4］设计了一种 RIA 法检测 7 － O － DHEA 的方法，方法检测限为 0. 06 pmol / 管，日内日间差异为 4. 1% 和 8. 3% ，加标回收率为 78. 8% ～ 112% 之间。
6结论
紫外 － 可见光分光光度法和荧光分光光度法的灵敏度不够 高，不能准确定量生物样品中的痕量脱氢表雄酮。
免疫法的灵敏度很高临床检测中应用较多。然 而免疫法的特异性往往较差，存在交叉反应的影响。Kazihnitkova 等［15］用 RIA 法检测小鼠脑组织中脱氢表雄酮时发现，脱氢 表雄酮与脱氢表雄酮硫酸酯的交叉反应为 106% ，日内、日间 变异在 14. 5% ～ 25. 3% 之间。由于抗体设计不同等因素，会造 成不同免疫 法 的 检 测 结 果 存 在 差 异，因 此 在 检 测 同 一 批 样 品 时，尽量选用 同 一 型 号 同 一 批 次 制 备 的 抗 体， 以 减 少 批 间 效 应。
Key words： biological samples； dehydroepiandrosterone； dehydroepiandrosterone sulfate； determination method
脱氢表雄酮 （ DHEA） 是人体含量极为丰富的激素之一， 与人体的健康息息相关。人体内脱氢表雄酮和脱氢表雄酮硫酸 酯可以互相转换，脱氢表雄酮多以硫酸酯的形式在体内循环。 脱氢表雄酮及硫酸酯具有一些生理作用，比如神经保护、促进 神经元再生、抑制细胞毒性和抗糖皮质激素作用等，与肥胖、 糖尿病、动脉粥样硬化、抑制癌症发生、治疗阿尔兹海默病等 有关。研究还发现，脱氢表雄酮及硫酸酯与长期应激、焦虑、 抑郁、自闭症等有关。
准确检测生物样品中脱氢表雄酮和脱氢表雄酮硫酸酯在生 理疾病和心理状态的诊断都具有重要意义。
1 紫外 － 可见光分光光度法
由于甾体环和一些酮羰基的存在，甾体激素都具备一定的 紫外吸光度。
Gergely 等［1］使用反相离子对高效液相色谱 － 圆二色光谱仪 在 295 nm 处检测脱氢表雄酮及硫酸酯，该方法使用含 20 mM 硫酸铵的甲醇 （ 30% ～ 100% ） 作为流动相，四丁铵阳离子配 对交换，线性范围为 0. 5 ～ 2 mg / mL，加标回收率在 99. 1% ～ 100. 8% 之间，日内日间精密度均大于 98% 。
［2］ W． CHEN，H． ZHANG，Q． GUO，et al． Determination of Steroids from Rat Feces by High Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Derivatization and Identification by On － line Mass Spectrometry［J］． Chinese Journal of Analytical Chemistry，2006，34 （ 10 ） ： 1406 － 1412．