食品安全性评价

小鼠睾丸染色体畸变试验
目的：检测整体动物睾丸染色体畸变发生率，以评 价受试物对整体哺乳动物睾丸生殖细胞的致突变性。 原理：不同周期的雄性生殖细胞对化学物质的敏感 性不同，多数情况下化学诱变剂诱发染色体畸变必 须经过DNA复制期，故在前细线期处理。第12～14d 采样，以观察作用于前细线期引起的精母细胞染色 体畸变效应。
每日容许摄人量(ADI)和最高允许浓度(MAC)
最小有作用剂量—一定时间内，一种外来化合物按 一定方式或途径与机体接触，能使某项观察指标开 始出现异常变化或使机体开始出现损害作用所需的 最低剂量
效应和反应效应 剂量一效应关系和剂量一反应关系
毒理学安全性评价程序的内容
试验前的准备
化合物的有关基本数据 生产过程中所用的原料和中间体 应用情况及用量 应是实际生产使用的或人类实际接触的产品 选择实验动物的要求
根据一定的程序对食品所含有的某种外来化合物进行毒性实 验和人群调查，确定其卫生标准，并依此标准对含有这些外 来化合物的食品做出能否商业化的判断过程。
1994年颁布了《食品毒理学安全性评价程序和方法》标准 (GBl5193．1—94)
概述
基本概念
毒性 ：指外来化合物能够造成机体损害的能力。
量（关键因素）、途径、方式
90d喂养试验、繁殖试验、代谢试验
第四阶段慢性毒性试验
致癌试验
食品毒理学安全性评价程序
不同受试物选择毒性试验的原则
凡属我国创新的物质一般要求进行全部四个阶段的试验 与已知物质的化学结构基本相同的衍生物或类似物，则根据
第一、二、三阶段毒性试验结果判断是否需进行第四阶段的 毒性试验 凡属已知的化合物质，WHO已公布每日容许摄入量者，同 时申请单位又有资料证明我国产品的质量规格与国外产品一 致，则可先进行第一、二阶段毒性试验，如果试验结果与国 外产品的结果一致，一般不要求进行进一步的毒性试验，否 则应进行第三阶段毒性实验。
小鼠精子畸形试验
目的： 检测整体动物体内精子畸形发生率，以评价受试物对体 内生殖细胞的致突变作用。 原理： 小鼠精子畸形受基因控制，具有高度遗传性，许多常染 色体及X、Y性染色体基因决定精子形态。精子的畸形主 要是指形态的异常，已知精子的畸形是决定精子形成的 基因发生突变的结果。因此形态的改变提示有关基因及 其蛋白产物的改变。
鼠伤寒沙门氏菌（Ames）试验
观察及评价指标： 各受试物组及三个对照组的四种菌株（TA97a，TA98，
TA100和TA102）分别在加和不加S9情况下的菌落计数。 结果评价（掺入法）：
受试物组回变菌落数增加一倍以上（即回变菌落数 ≥2×未处理对照组数），并有剂量反应关系或有可重复 的阳性反应，即可判试验阳性。
小鼠睾丸染色体畸变试验
时间周期：一般为7周 3-5天适应期 小鼠经口连续染毒5天，与首次给样后
的12-14天处死动物取材，（取材前6h，腹腔注 射 秋水仙素）。取两侧睾丸，收集生殖细胞，滴片， 染色，镜检 剂量设计：同骨髓细胞微核试验
小鼠睾丸染色体畸变试验
观察及评价指标： 每只动物分析100个中期相细胞 ，记录染色体数目 及结构的改变（包括断片、易位、畸变细胞率、常 染色体单价体、性染色体单价体等）。 结果评价： 受试物组与对照组的断片、易位、畸变细胞率、常 染色体单价体、性染色体单价体等差异有统计学意 义，试验结果为阳性。
对特定化学物质产生毒害的可能性作出准确评 价，并进行有效管理对人类健康具有重要意义。
概述
毒理学安全性评价
通过动物实验和对人群的观察，阐明某种物质的毒性及潜在 危害，对该物质能否投放市场做出取舍的决定，或提出人类 安全的接触条件，即对人类使用这种物质的安全性做出评价 的研究过程。
食品毒理学安全性评价
骨髓细胞微核试验
观察及评价指标： 每只动物计数1000个嗜多染红细胞 ，记录含有微核的细 胞数，并计算微核千分率。观察嗜多染红细胞与成熟红 细胞的比例。 结果评价： 受试物组与对照组微核率相比，增高呈剂量反应关系并 有统计学意义，试验结果为阳性。
哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验
目的：检测受试物对整体动物骨髓细胞染色体畸变的致 突变性，以评价其致突变的可能性。 原理：当受试物作用于细胞周期G1期和S期时，可诱发 染色体型畸变，而作用于G2期时则诱发染色体单体型畸 变。给动物腹腔注射秋水仙素，抑制细胞分裂时纺锤体 的形成，增加中期分裂相细胞的比例，并使染色体丝缩 短、分散，轮廓清晰。在显微镜下便可观察染色体数目 和形态。
损害作用与非损害作用 剂量 ：决定损害作用的重要因素
致死量 —造成机体死亡的剂量 绝对致死量 —造成一群机体全部死亡的最低剂量 半数致死量 —能引起一群个体50％死亡所需剂量
一般以LD50±1．96标准差表示其误差范围
概述
最大无作用剂量 —一定时间内，一种外来化合物按 一定方式或途径与机体接触，根据目前认识水平， 用最灵敏的试验方法和观察指标，未能观察到任何 对机体的损害作用的最高剂量。
急性毒性（LD50）剂量分级表
级别
极毒 剧毒 中等毒 低毒 实际无毒 无毒
大鼠口服LD50， mg/kg
<1 1-50 51-500 501-5000 5001-15000 >15000
源自文库
相当于人的致死量
mg/kg
g/人
稍尝
0.05
500-4000
0.5
4000-30000
5
30000-250000
原理： 以不同剂量受试物每日经口给予各组实验 动物，连续30天。染毒期间每日密切观察动物的毒 性反应，染毒结束后进行大体解剖、血生化及病理 检查，以此观察重复喂食不同剂量的受试物对动物 引起的有害作用。
哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验
时间周期：一般为3周 3-5天适应期 小鼠或大鼠经口染毒2-4次，每次间隔24h，在
末次染毒18-24h进行取材（取材前2-4h，腹腔注射秋水 仙素）。
取股骨，收集骨髓，制片，染色，镜检 剂量设计：同骨髓细胞微核试验
哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验
观察及评价指标： 每只动物分析100个中期相细胞 ，每个剂量组不少于 1000个。记录染色体数目及结构的改变。 结果评价： 受试物组与对照组染色体畸变率相比，增高呈剂量反应 关系并有统计学意义，试验结果为阳性。
第一周，鼠伤寒沙门氏菌种、试剂、培养基准备 第二周，染毒，培养48h，读平板，菌落计数 剂量设计：决定受试物最高剂量的因素是对细菌的毒性及其溶解度。 最低剂量为0.2ug/ml；最高剂量为5mg/ml，或最大溶解剂量，最大 饱和剂量以及最小毒性剂量。可设五个剂量组，组间距不超过5倍。 同时设：阳性对照组，溶剂对照组和未处理对照组。
至少应选择清洁级动物 种属 、性别、年龄与数量
毒理学安全性评价程序的内容
不同阶段安全性评价的毒理学项目
第一阶段(急性毒性试验)
急性毒性试验 动物皮肤、黏膜试验 吸入刺激阈浓度试验
第二阶段(亚急性毒性试验和致突变试验)
30d亚急性毒性试验或20d蓄积试验 致突变试验 ：Ames试验 、微核试验
骨髓细胞微核试验
时间周期：一般为2周 3-5天适应期 小鼠经口染毒，30h给受试物法 取胸骨或股骨，收集骨髓，涂片，染色，镜检
剂量设计：至少设置3个剂量，最高剂量组为动物出现严重中 毒表现和/或个别动物出现死亡的剂量。低剂量组应不出现毒 性反应。一般取LD50的1/2、1/4、1/8作为三个剂量。当受试 物的LD50≥10g/kg.bw时，最高剂量通常采用10g/kg.bw。同 时设阳性对照组和溶剂对照组。
食品毒理学安全性评价程序
对受试物的要求
明确受试物的物理、化学性质 符合既定的生产工艺和配方的规格化产品，其
纯度应与实际应用的相同 途径主要有经口，经皮，经呼吸道三种 ，如无
特殊说明，一般指经口途径即灌胃或喂饲
食品毒理学安全性评价程序
毒理试验的四个阶段和内容
第一阶段急性毒性试验
经口急性毒性，LDso联合急性毒性。
急性经口毒性试验 鼠伤寒沙门氏菌（Ames）试验 骨髓细胞微核试验 哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验 小鼠精子畸形试验 小鼠睾丸染色体畸变试验 30天喂养试验
急性经口毒性试验
目的：测定LD50，毒性分级。了解毒性强度、性质和可能的靶 器官，为进一步的毒性试验提供剂量和观察指标的选择依据。 原理： 急性毒性：经口一次性、24h内多次给予，短时间内的毒性反 应。致死剂量通常用半数致死剂量LD50表示。 急性联合毒性：两种或两种以上的受试物，可能发生拮抗、相 加或协同的联合方式，可以根据一定的公式计算和判定标准来 确定这三种不同的作用。
小鼠精子畸形试验
时间周期：一般为7周 3-5天适应期 小鼠经口连续染毒5天，于首次给样后的35
天处死动物 取两侧附睾，收集精子，滴片，染色，镜检
剂量设计：同骨髓细胞微核试验
小鼠精子畸形试验
观察及评价指标： 每只动物检查1000个精子 ，记录精子畸形数目及 类型。 结果评价： 受试物组与对照组精子畸变率相比，增高呈剂量反 应关系并有统计学意义，试验结果为阳性。
第二阶段遗传毒性试验
必选项目：细菌回复突变试验(Ames试验)、小鼠骨 髓微核率测定或骨髓细胞染色体畸变分析、小鼠精 子畸形分析或睾丸染色体畸变分析
食品毒理学安全性评价程序
备选：基因突变试验，显性致死试验，果蝇伴性隐 性致死试验、程序外DNA修复合成试验、传统致畸 试验、短期喂养试验
第三阶段亚慢性毒性试验
50
250000-500000
500
>500000
2500
急性经口毒性试验
试验结果的判定： 1. LD50＜人可能摄入量的100倍，放弃；反之继续下 一步试验。 2. LD50≥10g/kgbw或按最大耐受量染毒而未出现动 物死亡的，可继续下一步试验。
鼠伤寒沙门氏菌（Ames）试验
目的：检测受试物的诱变性，预测其遗传危害和潜在致癌作用的可 能性。 时间周期：一般为2周
物种选择
○急性毒性试验常用 大鼠、小鼠、狗 ○亚慢性、慢性毒性试验常用 大鼠、狗 ○皮肤刺激试验和致敏试验常用 豚鼠 ○皮肤刺激试验和眼刺激试验常用 兔 ○遗传毒理学试验多用 小鼠 ○致畸试验常用 大鼠、小鼠和兔 ○致癌试验常用 大鼠和小鼠 ○迟发性神经毒性试验常用 母鸡
附：毒理学试验项目要点介绍
食品安全性评价
重点
食品毒理学安全性评价程序的四个阶段 内容、选用原则
各项毒理学试验结果的判定 食品毒理学安全性评价需要考虑的因素
概述
必要性
多种多样的化学物质是一把双刃剑
创造大量物质财富，提高生活质量 给人类健康带来不利影响
目前常用的7万多种化学物质中约有10％为致突变物。 迄今为止，国际癌症研究机构确定约有60种化学毒 物或生产过程对人类有致癌性。
急性经口毒性试验
时间周期：一般为3周 3-5天，大、小鼠适应期 7-14天，染毒及实验观察期 发生动物死亡时，应进行大体解剖
观察和评价指标： 毒性反应症状：各器官系统的反常表现（中枢、自主神经、呼 吸、心血管、胃肠、生殖泌尿系统、皮毛、粘膜等）及体重变 化 死亡情况：死亡的时间、数量、性别、表现等。 大体尸检结果：如果发生死亡动物
遗传毒性试验组合
试验结果的判定： 如三项致突变试验（Ames试验，微核或骨髓细胞染 色体畸变试验，精子畸形或睾丸染色体畸变试验） 中，体外或体内有一项或以上阳性，一般应放弃该 受试物用于保健食品。 如三项试验均为阴性，则可继续进行下一步的毒性 试验。
30天喂养试验
目的：急性毒性试验的基础上，此试验可进一步了 解毒性作用，特别是观察对生长发育的影响，并可 初步估计最大观察到的无作用剂量，估计亚慢性摄 入的危害性。
毒理学安全性评价程序的内容
第三阶段(亚慢性毒性试验和代谢试验)
亚慢性毒性试验 ：90d亚慢性毒性试验和致畸试验、 繁殖试验
代谢试验(毒物动力学实验)
第四阶段(慢性毒性试验和致癌试验) 人群接触资料
皮肤刺激试验的数据来自于志愿者 、人体中毒剂量 和效应的材料来自于中毒事故的调查与记载 、人群 流行病学调查
骨髓细胞微核试验
目的： 检测整体动物体内骨髓嗜多染红细胞微核发生率，以评 价受试物致突变的可能性。 原理： 微核是在细胞有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞 形成细胞核时，仍然留在细胞质中的色单体或染色体的 无着丝点断片 。末期之后，单独形成一个或几个规则的 次核，被包含在细胞胞质内，因比主核小，故称为微核。