TAT-PTD的研究进展

TAT-PTD的研究进展
郭娜赵砚丽
河北省人民医院麻醉科
蛋白质转导结构域(protein transduction domain, PTD)或称细胞穿膜肽(cell penetrating peptides, CPPs)是一条以肽为载体的有效运输各种物质进入细胞及细胞核的系统[1]。

通过PTD携带的物质有全长蛋白质、DNA、化学药物、寡核苷酸、40 nm 磁珠和200 nm 脂质体等[2]。

目前已知的具有细胞穿膜效应的多肽序列如表1所示。

表1 具有细胞穿膜效应的多肽序列
最常用的蛋白质转导结构域如：Antp43-58 (Antenapedia, 黑腹果蝇触足肽) 、TAT47-57 ( transactiviting protein, HIV-1 反式激活蛋白) 、VP22 (单纯疱疹病毒转录调节蛋白) 和Arginine-rich peptides (精氨酸富含肽) 等。

本文主要介绍TAT-PTD。

1 HIV-1 TAT-PTD
TAT蛋白是HIV后期转录的调控子，是HIV-1的LTR 反式激活基因所表达的一种蛋白，可以正调控HIV-1基因组的转录和复制，在HIV 的生活史中起着极其重要的作用，对HIV的复制是必须的，TAT 有86个氨基酸残基，由长为72个氨基酸与14个氨基酸的2个外显子
组成。

上个世纪80 年代末，Green和Frankel两个独立的小组同时发现TAT蛋白能够穿过培养的细胞膜进入到其他细胞中。

TAT 可以有效地介导外源物质进入细胞。

1988 年，Maurice 和Paul发现TAT 蛋白能够穿过细胞膜。

1994 年，Stephen将TAT 蛋白与其他外源蛋白用化学方法交联，成功地将外源蛋白质导入到了体外培养的细胞以及动物组织中，但以这种化学键连接后的融合蛋白在脑组织和肾脏中没有活性。

1997 年，Eric Vives 等发现剪切后的TAT 蛋白能够穿过细胞膜并在细胞核中聚集，并确定该蛋白转导的基本区段(basic domain) 为TAT 37～72 。

到1998 年，Hikaru发现TAT蛋白的PTD 区段(protein transduction domain) 与其他蛋白融合表达的蛋白质(TAT-蛋白质) 能够高效地进入体外培养的细胞，并且表现出生物学功能，具有生物学活性。

1999 年，Schwarze S. R.[3]研究发现：TAT 蛋白能够通过血脑屏障，积累到一定浓度并表现出蛋白的活性。

2000 年，Lewin 等利用TAT蛋白将直径为45nm 的包裹有磁性微球的葡聚糖导入到细胞中。

2001 年，Akiko Eguchi 等[4]利用TAT蛋白将外源基因导入到细胞，并且检测到较强的外源基因所表达的萤光素酶的活性。

近些时候，严世荣、李敬风等将TAT蛋白的PTD 区段编码基因与外源蛋白基因连接表达融合蛋白，再将其转入小鼠体内，发现融合蛋白可以快速到达体内各组织，且表现出较强生物活性。

2 机制
关于蛋白质转导结构的透膜机制目前仍不十分清楚，但是已证明这种穿膜方式是不依赖于受体、通道、能量及胞吞作用。

最近一些研究表明，用D-型氨基酸替代TAT(48 - 60)的L-型氨基酸，结果发现转导效率增强了；用TAT的颠倒结构同原始结构有同样作用；而且发现在变性条件下，蛋白质转导的能力增强；人工合成的分枝多肽(Rn) 4 中精氨酸的数目与其转导效率有关；带有胍基的拟肽也有同样作用，均可转导多种类型的细胞，均说明并非受体、配体作用模式。

还有研究发现TAT(48 - 60)可以在细胞不能进行内吞的4 ℃条件下转导，用内吞作用的多种抑制剂，均不能抑制其转导作用，说明蛋白转导不是通过胞吞作用的。

另外，用叠氮钠和鱼藤酮阻止ATP产生，也不能抑制TAT(48 - 60) 衍生肽的转导作用，说明蛋白质转导并非能量依赖性。

用药物阻断细胞通道，如brefelclin A(一种高尔基体蛋白转运抑制剂) ，仍不能抑制蛋白的转导。

用PTD 碱性多肽处理细胞，并未发现细胞内乳酸脱氢酶外漏，可能不是通过膜通道进入细胞。

实验证明，在4 ℃时尽管胞吞作用已失活，但是PTD和PTD 融合蛋白仍能快速有效地进入细胞。

热力学实验证明，TAT-PTD 与细胞表面糖胺聚糖的解离系数约为1μmol/L，比同样带有负电荷的脂质膜大3个数量级。

因此，TAT-PTD 与细胞表面糖胺聚糖的结合比脂质双层膜更为可能；PTD 与三个不同的糖氨聚糖(硫酸肝素、肝素和硫酸软骨素B) 有相似的热动学结合常数( K)，但结合点数目大致与硫酸化程度有关。

研究表明，使用糖氨聚糖裂合酶选择性地降解硫酸肝素侧链，可竞争性抑制TAT 的转导。

相反，如果加入的是主要作用于肝素而基本上不作用硫酸肝素的肝素酶，只有当该酶达到较高浓度时才能对TAT的转导起抑制作用。

可以分解各种硫酸软骨素的软骨素酶A 、B 、C，以及特异性分解硫酸软骨素A和C 的软骨素酶A和C，对TAT-PTD 的转导能力没有影响。

以上结果也提示，生物膜上的糖氨聚糖可能是PTD及相关蛋白的结合位点。

细胞表面的硫酸肝素是跨膜的硫酸肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycans , HSPG) 的膜外部分，这些HSPG可能是多种生物活性物质的共同受体。

在无配体存在时，HSPG在细胞表面随机分布。

当有特异性配体时，HSPG发生聚集并与细胞浆中的其他成分共同作用。

在硫酸肝素上，可能存在有PTD阳性肽的几个独立的结合位点，PTD与硫酸肝素的紧密结合并形成中性PTD-糖氨聚糖复合物，为PTD的跨膜转导提供了固相化基础，并通过HSPG相互交联，激活细胞的摄取。

这也解释了以PTD为载体介导的转运效率与细胞类型有关，因为有些细胞表面仅有少量的HSPG。

最近的一些研究表明，在细胞内PTD及其复合物存在于内吞体内。

提示细胞对PTD及其复合物的摄取可能通过细胞膜快速的静电作用，随后内吞到细胞内。

但并不排除尚存在其他摄取机制。

3 TAT-PTD与被转导物质的连接方式
PTD与蛋白质、肽、寡核苷酸、DNA 及肽核酸等连接的方式有两种：非共价连接和共价连接。

非共价连接，与脂质体转运方法相似简单易行，PTDs 与寡核苷酸
或DNA按一定比例混合，在室温共同孵育加入到培养细胞中，PTDs可
携带寡核苷酸或DNA进入细胞。

共价连接主要有3种方法：1)化学合成，用共价键连接形成复合物
或采用T4连接酶，如TAT(47-57)通过二硫键与肽核酸或锁核酸连接，
进入细胞后二硫键断裂，释放出化合物发挥反义作用，在体内不被巨
噬细胞吞噬，血液成分也不影响其摄取过程，在细胞内的作用时间延
长；2) 间接连接途径，构建含有VP22 的目的蛋白的cDNA 表达载体，
转染细胞12～24 h后，表达出融合蛋白能从转染的细胞进入周围其他
细胞；3) 体外构建融合聚肽，其N端或C端带标签序列，通过大肠埃
希菌表达载体产生大量的PTDs重组蛋白，进入细胞后，PTDs与蛋白质
间的连接断裂，释放出的蛋白质重新折叠。

利用这种方法，已得到大
量不同相对分子质量与PTDs连接的蛋白质，细胞毒性检测复合物几乎
没有毒性。

4TAT-PTD 融合蛋白的制备
TAT融合蛋白一般用以下的程序制备。

首先，将编码TAT-PTD 的cDNA 插入质粒(如pET32a) 中，构建TAT-PTD 的表达载体。

再将编码目的蛋白质或多肽的cDNA 插入到该载体的TAT-PTD 序列框架的下游，再将其转化入大肠杆菌中，即可表达TAT-PTD 融合蛋白。

TAT-PTD 融合蛋白少数以一种可溶的形式在细菌中被表达，但大多数是以不可溶形式出现在细菌的包含体内。

尿素可使贮存在包含体内的蛋白变性溶解。

用含有尿素的Ni2+-NTA 琼脂糖亲和柱来纯化蛋白，再用离子交换柱或凝胶过滤法除去尿素。

可以观察到变性的TAT-PTD 融合蛋白能进入几乎所有的细胞[5]。

5 TAT-PTD的不同应用
目前将基因、蛋白导入细胞的方法包括磷酸钙共沉淀法、显微注
射法、电击穿孔法、穿孔蛋白、ATP 处理、脂质体法、脂质转染法、
细胞融合法、病毒载体转染法等，但这些方法存在着以下问题：大量
细胞能否在相当长的一段时间内接受试剂的处理、是否需要外界的作
用(如运用电场)、进入细胞的蛋白量有多少、各个细胞吸收的剂量是否
相同、技术的可重复性有多大；细胞在处理中是否受到伤害或发生改
变、效率低、需要昂贵的试剂、特殊的设备、技术复杂不易掌握、安
全性等。

以上问题在一定程度上限制了这些方法的应用。

目前，大量研究表明PTD具有强大的运载潜能。

PTD 不仅可以携带多肽、GFP、RNase A、半乳糖苷酶等蛋白质，而且可以携带DNA、反义核酸、FITC、有机分子、脂质体、以及铁颗粒等无机物。

运载能力可以达到120 kD (如半乳糖苷酶)、40 nm (如铁颗粒) ，没有明显的证据表明PTD有运载极限[2]。

某些药用生物分子，如：蛋白质、DNA 及小分子化合物进入细胞内或细胞核内都要受到这些物质本身理化性质的影响。

其穿膜能力主要受以下几方面影响：脂溶性、极性、分子量。

脂溶性大、分子量小的生物分子容易穿过细胞膜；反之，极性大、分子量大的生物分子不易穿过细胞膜。

有些化合物不能直接进入细胞、细胞核内，限制了这些化合物作为药物的使用。

许多疾病的治疗需要大分子物质，如脑血管疾病常常需要神经生长因子、超氧化物歧化酶等保护剂，由于其难以透过血脑屏障，不能达到有效的治疗浓度。

因此，建立和发展高效、安全、可控、简便、实用的细胞内生物大分子导入系统和核转移体系，已经成为疾病防治的一个重要课题。

对于开发上述这些药物，PTD的发现极具意义，有着广泛的作为药物传递的前景。

在细胞及器官移植领域，目前多采用腺病毒基因转染等方法研究一些有保护作用的蛋白，但均因其病毒源性、转染复数低等问题限制其广泛应用。

PTD已经应用于AIDS 的研究，TAT-胱天蛋白酶原3 (TAT-procaspase-3) 进入到HIV感染的细胞后能够在HIV编码的特异蛋白酶的作用下切割为成熟的胱天蛋白酶3 ( caspase-3 ) ，从而诱导细胞凋亡。

在癌症研究方面，已经利用PTD携带P53蛋白诱导癌细胞的调亡，另外，在体内和/或体外还成功进行了PTD转运HSV-1 胸苷激酶、周期蛋白A(cyclin A) / cdk2 抑制肽、脂质体包被的阿霉素(Doxrubicin) 等肿瘤抑制药物的实验。

外源性GDNF能使缺血大鼠脑梗死灶体积缩小，脑水肿减轻。

Kilic 等[6]采用C57BL/6j 鼠制作MCAO 30min 再灌注模型，再灌注后10 min 尾静脉注射TAT-GDNF，3 d后处死大鼠，TTC 染色发现梗死体积明显小于GDNF组，免疫组化显示TAT-GDNF 组纹状体胱冬酶-3活性降低，存活神经元较对照组增多。

Cao 等[7]构建了TAT-PTD与Bcl-XL的融合蛋白，检测其在缺血再灌注损伤时的神经保护作用。

结果发现，将PTD-Bcl-XL加入皮质神经元培养基中，几乎所
有细胞内均有蛋白转导，且转导速度惊人，15 min 即达高峰，能显著抑制星形孢菌素(staurosporine) 诱导的神经元凋亡。

在局灶性脑缺血模型中，缺血前2 h 腹腔注射PTD-Bcl-XL 预处理大鼠，可使梗死体积缩小40 %，而且缺血后45min 内给药仍然有效，但缺血120 min后给药则无效。

Asoh 等发现，将PTD融合到FNK蛋白产生PTD-FNK蛋白，这种蛋白对体外培养液中正在凋亡的皮质神经元有保护作用，在沙土鼠短暂性全脑缺血模型中，PTD-FNK可使61.8 %～89 %海马CA1神经元存活，FNK的保护作用较野生型Bcl-XL 更强。

丁劲等构建及表达乙肝病毒靶向核糖核酸酶与TAT-PTD融合表达的原核表达载体，为体内应用靶向核糖核酸酶治疗乙型肝炎奠定了基础。

Schwarze小组还发现，变性的蛋白质似乎比正确折叠的蛋白质的转移还有效。

他们指出，一旦变性蛋白质进入细胞，在分子伴侣的帮助下，这些变性蛋白质能恢复正确折叠。

蛋白质纯化过程中变性，既有利于提高回收率，又能提高转导效率。

最近，Eguchi等[4]构建重组λ噬菌体，将TAT蛋白呈现于噬菌体表面，这个重组噬菌体成功地将内部所携带的外源基因导入了哺乳动物细胞；说明TAT蛋白还可以作为一个元件，去构建其他的转运系统，使其应用更加广泛。

2001年，S.Y. Choi等发现TAT-CAT可有效透过动物外皮，并在表皮层和真皮层中有大量聚集(49-57aa)，这为透皮给药提供了一种新思路。

现在，直接用细菌表达的TAT-PTD 融合蛋白或用编码VP22 基因的重组质粒转染细胞来解决生物学难题已取得了突破性进展。

虽然两种方法的建立都意味着对DNA 转染或病毒转染技术的巨大改进，但是二者相比，直接使用TAT-PTD 融合蛋白在实际应用中有几个优点：(1) 对于象原代细胞这样难以转染的细胞而言，TAT-PTD 融合蛋白系统无疑优于VP22 重组质粒转染法，实际操作中所有细胞都可成为转导的对象。

由于每个细胞含有相同的胞内蛋白质浓度，所以只要控制加入到培养介质中的蛋白量就可以轻而易举地控制胞内蛋白的浓度。

(2) 由于TAT-PTD 融合蛋白迅速进入细胞内部，5min后胞内最大浓度开始降低，所以可以精确地控制时间。

例如，可将融合蛋白在细胞周期某一特定相加入，以保证生物活性发生在蛋白加入后的几分钟内[3]。

综上所述，TAT-PTD具有如下特点：①TAT-PTD可以非常高效（100%）将与其融合的蛋白质在体外转入各种细胞及细胞核中；②TAT-PTD这种高转导活性在体内仍能进行；③TAT-PTD可穿过血脑屏障，并只进入灰质细胞中；④TAT-PTD可以将变性的蛋白质以更高的效率转入细胞内，且这些蛋白质在细胞内仍能复性；⑤TAT-PTD介导融合蛋白进入细胞是非受体介导的。

但是，TAT 蛋白是艾滋病毒1型(HIV-1) 的LTR反式激活基因所表达的一种蛋白，它不但可以正调控HIV-1基因组的转录和复制，还可以分泌到胞外，抑制免疫细胞的分化和增殖，文献资料表明，在HIV感染早期细胞外TAT蛋白的存在和感染者的免疫抑制密切相关。

细胞外TAT蛋白诱导免疫细胞发生凋亡[8]利于HIV的感染和体内传播。

同时还能促进卡波氏肉瘤肿瘤细胞的发生、生长，还可直接或间接作用于皮质层和皮质下层区引起神经系统的损害[9,10]。

6 展望
蛋白质转导技术仍处于较初级阶段，它是介导生物活性分子转移的一种新方式，在那些不需要长期和可调控表达转入基因的应用中，它有特别的作用，而且技术简便，可以避免目前基因治疗中的一些副作用；在实体瘤的治疗和细胞及器官移植的保护性研究中，蛋白质转导比目前病毒载体介导的转移效率更高，在未来基础研究和药物开发等方面将有广阔的应用前景[5]：可设计全新的复合物治疗各种疾病，还可根据组织细胞特点，对PTD进行修饰，以增加其组织特异性，特异杀伤肿瘤细胞。

在未来，蛋白质转导技术在三个重要方面可能有所突破：(1) 增加转导能力，蛋白TAT的本质作用是与细胞核内核酸相互作用。

因此，通过化学修饰或改构有可能进一步提高其转导效率；(2) 增加组织器官的靶向性，由于目前的TAT-PTD 可进入机体几乎所有的细胞，因此根据机体组织细胞的特点对TAT-PTD 进行修饰，增加其组织特异性；(3) 提高转导全长蛋白质和功能区的重折叠效率，在体外培养的细胞中，重折叠是限速步骤，因此，了解重折叠机制并加以利用将提高蛋白质的转导效率。

实际上，使用这种方法，将可能设计出全新的复合物来治疗病毒感染性疾病、特异性杀伤肿瘤细胞、补充体内由于基因缺失
而缺少的蛋白质及治疗神经退行性疾病等。

TAT-PTD 可以携带活性目的多肽、蛋白质、核酸或药物进入细胞内及核内，影响细胞内及核内的基因表达调控，从而达到平衡细胞生长，治疗疾病的作用。

但是，仍有几个重大问题亟需解决。

第一，许多PTD 融合蛋白在组织中仅需很低的浓度即可表现出生物活性，所以需要详细了解蛋白的转导能力，进而控制其能引起相应表型变化的量。

第二，关于穿膜蛋白在免疫遗传学的研究也具有重要意义，但是近年来仍未对此展开研究。

虽然今后在用于治疗疾病的蛋白中，可能99%都来源于人体，但是PTD却可能有抗原性，或者可能由于其传递过程中的某一环节而引发免疫应答。

PTD有多种变异类型，因此，可以通过变换其具有抗原性的氨基酸残基或变换TCR识别位点来减少免疫反应。

第三，这些蛋白转导域多是病毒相关蛋白的核定位序列。

用于携带药物对人进行治疗时，其对人类基因表达的潜在影响及可能带来的毒副作用目前报道较少，有待进一步研究。